FGF-1對TGF-β1誘導的H9c2心肌細胞凋亡與Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9表達的關系研究*

李厚忠，郭金興，張勝強，張羽飛

（1.牡丹江醫(yī)學院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011）

酸性成纖維細胞生長因子（acidic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF-1）是一種廣泛存在于人體各組織中的具有多方面功能的生物活性蛋白，其在組織形態(tài)的發(fā)生、發(fā)展，血管生成以及創(chuàng)傷愈合等諸多方面發(fā)揮著十分重要的作用[1]。同時，F(xiàn)GF-1也是成纖維細胞、血管內皮細胞、角膜細胞、心肌細胞、星形膠質細胞及神經細胞等生長的刺激因子[2]。研究表明[3]，F(xiàn)GF-1可緩解心肌短暫缺血引起的心肌梗死和心律失常等臨床癥狀。也有研究表明[4]，對于由缺血造成心肌的損傷（缺血-再灌注損傷），F(xiàn)GF-1可通過增加血管生成發(fā)揮心肌保護作用。但是，有關于FGF-1是否具有抗心肌細胞凋亡作用，國內外鮮見報道。本研究采用體外培養(yǎng)心肌H9c2細胞，建立轉化生長因子 -β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 誘導的H9c2細胞凋亡模型，觀察FGF-1對H9c2細胞存活率，凋亡指數(shù)以及凋亡相關酶半胱氨酸蛋白 酶 -3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3），半胱氨酸蛋白酶-8（cysteinyl aspartate specific proteinase-8，Caspase-8）和半胱氨酸蛋白酶-9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9）表達的影響，探討FGF-1抗H9c2細胞凋亡作用及可能的作用機制，為其進一步研究開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

心肌細胞株H9c2（中科院上海細胞研究所細胞庫），F(xiàn)GF-1（美國R&D system公司），肝素（Heparin，美國 Sigma公司），TGF-β1（美國 PEPROTECH 公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，美國Amresco公司），DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清（美國Gibco公司），TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（南京凱基生物有限公司），DAPI（上海碧云天公司），兔抗人caspase-3單克隆抗體、兔抗人caspase-8單克隆抗體和兔抗人caspase-9單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），HRP標記抗鼠IgG二抗（上海碧云天公司），其他試劑均為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) H9c2細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、200 mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/ml硫酸鏈霉素、100 u/ml青霉素鈉）中，37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，待細胞達80%匯合度時，傳代。收集對數(shù)生長期細胞，制成單細胞懸液用于進一步實驗。

1.2.2 MTT比色分析檢測H9c2細胞存活率 取對數(shù)生長期H9c2細胞，調節(jié)細胞密度為1×105個細胞/ml細胞懸液，接種于96孔板中，每孔200μl，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。待細胞貼壁后棄上清，參照文獻[5]及預實驗結果，TGF-β1模型組每孔加入DMEM培養(yǎng)基，Heparin組每孔加入100μg/ml Heparin，F(xiàn)GF-1組每孔加入20 ng/ml FGF-1，F(xiàn)GF-1/Heparin組每孔加入20 ng/ml FGF-1和100μg/ml Heparin，正常對照組每孔加入DMEM培養(yǎng)基，每組設6個平行孔。37℃、5%CO2及飽和濕度下分別培養(yǎng)12 h，棄上清。正常對照組每孔加入DMEM培養(yǎng)基，其余各組均每孔加入20 ng/ml TGF-β1，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，各組每孔加入MTT溶液（0.5 mg/ml）20μl，37℃、5% CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150μl，振蕩10 min。Rayto RT-6100酶標儀于490 nm波長處測定A值。計算細胞存活率。存活率（%）=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%，取6孔平均值。

1.2.3 TUNEL染色檢測H9c2細胞凋亡 使用TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒檢測FGF-1對TGF-β1誘導的H9c2細胞凋亡的影響。給藥及分組方法同“1.2.2”，PBS沖洗2次，每次 3 min，然后-20℃甲醇固定15 min。PBS沖洗3次，每次3 min，加入50μl TUNEL反應液，避光37℃孵育1 h。PBS沖洗2次，每次3 min，Hoechst 33258染料37℃避光染色10 min。Olympus BX43熒光顯微鏡觀察細胞核的形態(tài)。每個圖片隨機選取6個高倍視野，計算凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI），AI（%）=TUNEL陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.4 Western blot檢測 給藥及分組方法同“1.2.2”，加入含有25 mmol/L HEPES、1% Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、1 mmol/L PMSF和1μg/ml亮肽素的冰冷的裂解緩沖液（pH=7.4），10 000 r/min 4℃離心10 min，棄沉渣，收集上清液，BCA法測定總蛋白濃度。取30μg蛋白上樣后進行10%SDS-PAGE凝膠電泳。當電泳完成后，電轉至0.45μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉PBST 4℃封閉2 h。然后加入兔抗人caspase-3單克隆抗體，兔抗人caspase-8單克隆抗體，兔抗人caspase-9單克隆抗體（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。PBST洗滌后，加入生物素標記的山羊抗兔第二抗體（1∶500稀釋）室溫孵育2 h。PBST洗滌3次，每次5 min，ECL化學發(fā)光試劑顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對各組條帶進行計值及統(tǒng)計學分析。β-actin抗體孵育方法與上述方法相同，蛋白的相對表達水平=目標蛋白表達水平/β-actin蛋白表達水平。每份樣品檢測6次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較，采用單因素方差分析，組間兩兩比較，采用SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FGF-1對TGF-β1誘導的H9c2細胞存活率的影響

MTT比色分析結果顯示，模型組H9c2細胞存活率降低，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；FGF-1組 和 FGF-1/Heparin組 H9c2細胞存活率升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。以上結果表明，F(xiàn)GF-1對TGF-β1誘導的H9c2細胞損傷具有保護作用。見圖1。

2.2 FGF-1對TGF-β1誘導的H9c2細胞凋亡的影響

TUNEL染色結果顯示，模型組H9c2細胞凋亡指數(shù)升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；FGF-1組 和 FGF-1/Heparin組 H9c2細胞凋亡指數(shù)降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。以上結果表明，F(xiàn)GF-1對TGF-β1誘導的H9c2細胞凋亡具有抑制作用。見圖2。

2.3 FGF-1對TGF-β1誘 導 的H9c2細 胞Caspase-3、Caspase-8和 Caspase-9表達 的影響

Western blot結果顯示，模型組H9c2細胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；FGF-1組和FGF-1/Heparin組H9c2細胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。以上結果表明，F(xiàn)GF-1對TGF-β1誘導的H9c2細胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達具有抑制作用。見圖3。

圖1 FGF-1對TGF-β1誘導的H9c2細胞存活率的影響

圖2 FGF-1對TGF-β1誘導的H9c2細胞調亡的影響

圖3 FGF-1對TGF-β1誘導的H9c2細胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達的影響

3 討論

FGF是一類多肽類物質，其中大多數(shù)成員可與肝素結合發(fā)揮作用，單獨作用對細胞效果一般。因此，一般使用肝素與FGF-1一起作用，提高FGF-1的藥效[6]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-1可提高H9c2細胞的存活率，F(xiàn)GF-1對H9c2細胞具有明顯的保護作用。

細胞凋亡是指發(fā)生在生理狀態(tài)下的細胞程序性死亡，其特點是不發(fā)生炎癥反應。本研究TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-1對TGF-β1誘導的H9c2細胞凋亡具有抑制作用。細胞凋亡受分子水平的調控[7]，為探討FGF-1對TGF-β1誘導的H9c2細胞抗凋亡的可能機制，本研究對Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9進行了檢測。Caspases是在細胞凋亡中起關鍵作用的酶家族，是細胞凋亡的介導者和執(zhí)行者，激活或超量表達均會引起細胞凋亡，又稱凋亡蛋白酶，對凋亡起關鍵作用[8]。有研究表明[9]，細胞的凋亡是由于Caspase逐步發(fā)生級聯(lián)反應引起的。Caspase-3位于Caspases級聯(lián)反應的下游，被認為是誘導細胞凋亡真正的實施者[10]。經典的細胞凋亡途徑分為2條，包括細胞外途徑和細胞內凋亡途徑[11]。在細胞外途徑過程中，死亡配體和相對應的受體結合形成死亡信號，接著再與信號傳導分子相連接，進一步和Caspase-8結合，形成死亡誘導信號復合物，從而使Caspase-8活化，當Caspase-8直接與Caspase-3發(fā)生作用，Caspase-3被激活，進而誘導細胞凋亡[12]。而細胞內途徑也稱為線粒體途徑，在此途徑中，凋亡刺激因子與凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic protease activating factor 1，APAF1）形成多聚復合物，然后胞質中的Caspase-9前體結合，形成巨大復合物，巨大復合物引起Caspase-9前體活化，Caspase-9再激活下游的Caspase-3，從而發(fā)生級聯(lián)反應，最后誘導細胞凋亡[13]。心肌細胞的凋亡作用可能是非缺血和/或缺血性心肌病患者心肌細胞死亡的一種形式。一旦心肌細胞發(fā)生凋亡，原有的心肌即被膠原纖維所取代，繼而心肌就會進一步發(fā)生纖維化、肥厚、心室重構等，最終發(fā)展至心力衰竭[14]。因此，有關于心肌細胞的凋亡作用及機制越來越受到國內外學者的廣泛重視。研究表明，TGF-β1是在HF過程中急劇增加的細胞因子中的一員，心肌細胞在TGF-β1的刺激下可發(fā)生細胞凋亡，TGF-β1作為導致心肌纖維化諸多因素最后的共同中介之一，被認為是影響心肌纖維化最直接，也是最重要的細胞因子[15]。本研究Western blot結果顯示，F(xiàn)GF-1對TGF-β1誘導的H9c2細胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達也具有抑制作用。以上結果提示，F(xiàn)GF-1可能通過抑制Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表達從而對TGF-β1誘導的H9c2心肌細胞具有抗凋亡作用。

終 上 所 述，F(xiàn)GF-1對TGF-β1誘 導 的H9c2心肌細胞凋亡具有抑制作用，其機制可能與抑制Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表達有關。

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