一例豬藍(lán)耳病繼發(fā)感染副豬嗜血桿菌的診斷及防治

劉 杰，李英英，孫 哲，劉維康，劉守川，趙坤坤

（洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司，河南 洛陽 471000）

2017年5月洛陽某豬場保育豬出現(xiàn)咳嗽，喘氣、關(guān)節(jié)腫大等癥狀。對(duì)3頭發(fā)病豬進(jìn)行剖檢，取病變組織進(jìn)行病原學(xué)鑒定，結(jié)果檢測出豬藍(lán)耳病毒、副豬嗜血桿菌。結(jié)合臨床癥狀、病理變化和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為豬藍(lán)耳病繼發(fā)副豬嗜血桿菌。

1 材料與方法

1.1 臨床情況及取樣

某豬場保育豬出現(xiàn)咳嗽，喘氣，關(guān)節(jié)腫大等癥狀，發(fā)病率30%，死亡率20%。選取3頭有發(fā)熱、咳嗽并伴跛行等癥狀的病豬進(jìn)行剖檢。剖檢可見心包積液增多、呈淡黃色，肺臟邊緣有黃色纖維素性滲出物，肺臟尖葉和心葉出現(xiàn)實(shí)變，關(guān)節(jié)積液增多，顏色微黃（圖1）。根據(jù)臨床癥狀及病理情況分別采集扁桃體、肺臟等組織進(jìn)行病原檢測和細(xì)菌分離。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），由青島海博試劑有限公司提供；革蘭氏染色試劑， 購自北京索萊寶科技有 限 公 司；DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker等購自寶生物（大連）工程有限公司；細(xì)菌微量生化管及藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；病毒核酸提取試劑盒，購自臺(tái)灣旭基。

1.3 方法

1.3.1 病毒樣品處理

取肺臟和扁桃體健康部位與病變部位的交界處0．5 g置于滅菌平皿內(nèi)，用眼科剪剪碎，置于玻璃研磨器中，并加入約1 mL滅菌PBS進(jìn)行研磨。將已研磨好的組織樣品勻漿液轉(zhuǎn)入15 mL滅菌離心管中用滅菌的PBS定容至5 mL，取1mL至1．5 mL滅菌離心管中，液氮及室溫反復(fù)凍融3次。

1．3．1．1 病毒 RNA 提取

取組織研磨液，8 000 r/min離心2 min，取上清液作為待檢樣品。分別取待檢樣品、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各200μL，按照病毒核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行核酸的提取。

1．3．1．2 cDNA 的制備

根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，20 ℃ 1 min，之后保存。

RT-PCR采 用20μL反 應(yīng) 體系， 即 2×ES Reaction Mix 10μL，EasyscriptRT/RI Enzyme mix 1μL，隨機(jī)引物1μL，RNA模板8μL。

圖1 剖檢圖片

1.3.2 細(xì)菌分離

無菌采取病死豬肺臟，分別接于含TSA+血清培養(yǎng)基、血平板和TSA+血清+NAD培養(yǎng)基，37 ℃，厭氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和常規(guī)細(xì)菌生化試驗(yàn)。

1.3.3 分子鑒定

根據(jù)豬藍(lán)耳病毒序列，參照GenBank PRRSV的全基因序列中的ORF7末端序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性的引物，序列為：5’-GAA TGG CCA GCC AGT CAA TC-3’， PRRSV-436R ：5’-GTC GCC CTA ATT GAA TAG GTG AC-3’，擴(kuò)增出目的片段大小為436 bp，該引物由英濰捷基（北京）貿(mào)易有限公司合成。

PCR采用25μL反應(yīng)體系，即10×PCRBuffer2．5μL、dNTP 2．0μL、DNA Taq 酶 0．5μL，PRRSV-436F/ PRRSV-436R 引 物 各 1．0μL，DNA 模 板 2．0μL，ddH2O 16．0μL。PCR反 應(yīng) 條 件 為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，20 ℃ 1 min后保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA基因，張盼峰等[1]設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，引物序列為：P1：5’-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3’，P2：5’-GTG ATG AGG AAG GGT GT-3’，擴(kuò)增出的目的片段大小為821 bp，該引物由英濰捷基（北京）貿(mào)易有限公司合成。

PCR采 用25μL反 應(yīng) 體系， 即 10×PCRBuffer2．5μL、dNTP 2．0μL、DNA Taq 酶 0．5μL，P1/P2引 物 各 1．0μL，DNA 模 板2．0μL，ddH2O 16．0μL。PCR 反應(yīng)條件為 ：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，共 30 個(gè)循環(huán) ；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1．5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.4 ERIC-PCR指紋圖譜分析

參照M RAFIEE等[2]報(bào)道提供的引物進(jìn)行分析，引物序列為：ERI C-1R：5’-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3’，ERIC-2：5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3’。

PCR采 用25μL反 應(yīng) 體系， 即 10×PCRBuffer2．5μL、dNTP 2．0μL、DNA Taq 酶 0．5μL，上 下 游 引 物 各 1．0μL，DNA 模 板2．0μL，ddH2O 16．0μL。PCR 反應(yīng) 條 件 為：95 ℃ 2 min，94℃ 30 s，50 ℃30 s，72 ℃6 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃6 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.5 衛(wèi)星試驗(yàn)及生化鑒定

取一塊沒有添加NAD的TSA血清平皿，在平板中間沿直徑線涂劃接種金黃色葡萄球菌，然后將疑似菌落垂直金黃色葡萄球菌線劃線接種，37 ℃，培養(yǎng)24 h后觀察是否出現(xiàn)靠近金黃色葡萄球菌線的菌落長勢較好，遠(yuǎn)離金黃色葡萄球菌線的地方無菌落生長的衛(wèi)星現(xiàn)象。

選取生化鑒定試管進(jìn)行試驗(yàn)，特別注意在進(jìn)行生化鑒定時(shí)，需要在生化鑒定管內(nèi)添加適量NAD。

1.3.6 藥敏試驗(yàn)

挑取疑似單個(gè)菌落接種于TSB+血清+NAD培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)5～6 h，取100μL均勻涂布于含TSA+血清+NAD培養(yǎng)基上。用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）[3]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選取頭孢噻呋、阿莫西林、甲砜霉素、硫酸黏菌素、阿米卡星、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素和氟苯尼考為試驗(yàn)藥物，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，根據(jù)說明書敏感和耐藥性的最小抑菌圈直徑判定菌株對(duì)所選藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

菌落形態(tài)為圓形隆起、表面光滑、邊緣整齊、小而透明的菌落（圖2），革蘭氏染色為陰性桿菌（圖3）。

圖2 菌落形態(tài)

圖3 革蘭氏染色鏡檢（1 000×）

2.2 分子鑒定結(jié)果

從豬藍(lán)耳病毒分子鑒定電泳圖結(jié)果（圖4），可以看到在第2、3泳道出現(xiàn)430 bp左右的特異性條帶，與我們?cè)O(shè)計(jì)引物擴(kuò)增的藍(lán)耳病病毒基因片段長度相符。

取單個(gè)純化且具有典型特點(diǎn)的菌落 進(jìn)行PCR鑒定，并設(shè)陽性和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照電泳結(jié)果條帶大小為821 bp左右，樣品條帶大小也為821 bp左右，陰性對(duì)照無條帶，根據(jù)結(jié)果判定為副豬嗜血桿菌，結(jié)果如圖5。

圖4 藍(lán)耳病毒分子鑒定結(jié)果

圖5 副豬嗜血桿菌分子鑒定結(jié)果

2.3 ERIC-PCR指紋圖譜結(jié)果分析

分離菌株進(jìn)行ERIC-PCR指紋圖譜分析，如圖6，將得到的ERIC-PCR指紋圖譜與學(xué)者Rafiee等發(fā)表的15種標(biāo)準(zhǔn)血清型的指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌株的圖譜與血清型5型的圖譜高度相似，并進(jìn)行血清型驗(yàn)證，鑒定結(jié)果為血清型5型。

圖6 ERIC-PCR結(jié)果

2.4 衛(wèi)星試驗(yàn)及生化鑒定結(jié)果

從圖7可看出，分離株在靠近金黃色葡萄球菌直線處生長較好，而遠(yuǎn)離金黃色葡萄球菌的地方基本沒有細(xì)菌生長。

從表1不難看出，分離到的菌株不發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖，氧化酶和尿素酶陰性，硝酸鹽還原酶和接觸酶陽性，靛基質(zhì)和VP試驗(yàn)陰性。與副豬嗜血桿菌的生化特性一致。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

挑取分離到的副豬嗜血桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，敏感藥物為頭孢噻呋、甲砜霉素、硫酸黏菌素、阿米卡星、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素和氟苯尼考。

表1 生化鑒定結(jié)果

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 總結(jié)

本次檢測結(jié)果為豬藍(lán)耳病毒陽性，副豬嗜血桿菌血清型5型陽性，根據(jù)其發(fā)病機(jī)理判斷為豬藍(lán)耳病繼發(fā)副豬嗜血桿菌。豬藍(lán)耳病是一種免疫抑制類疾病，尚無有效的治療措施，對(duì)其防治應(yīng)從以下幾個(gè)方面進(jìn)行。1)引種傳播是其傳播的重要途徑，因此應(yīng)堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，不從疫區(qū)和有過該病發(fā)病史的豬場引種是一種重要的預(yù)防措施 。2)嚴(yán)格控制豬舍環(huán)境，要嚴(yán)格執(zhí)行消毒制度，建立無毒清潔豬場，另外加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，及時(shí)調(diào)整豬群飼養(yǎng)密度，改善豬舍通風(fēng)采光，病毒的穩(wěn)定性受pH和溫度的影響較大，在pH小于5或大于7時(shí)，其感染力降低95%以上，豬舍內(nèi)可用pH較低的消毒液采用疫病期間的用藥劑量帶豬噴霧消毒，包括豬舍內(nèi)的用具每天徹底消毒。3)做好豬藍(lán)耳病免疫接種工作，商品仔豬在斷奶之后進(jìn)行初次免疫，每頭豬2 mL，在疫情暴發(fā)地區(qū)在初次免疫后30 d采用相同劑量進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，后備種豬在150日齡再次進(jìn)行免疫，每頭豬4 mL，母豬和種公豬每隔4個(gè)月進(jìn)行免疫1次，每次每頭4 mL。4)一旦豬場發(fā)病，要盡快將病豬隔離治療，而且主要從兩個(gè)方面進(jìn)行，一個(gè)方面是提高發(fā)病豬只的抵抗力，添加如黃芪多糖和復(fù)方花青素以增強(qiáng)畜體抗病毒、細(xì)菌感染的抵抗力，另一方面是使用抗生素，緩解癥狀和防止繼發(fā)感染，如將泰樂菌素、磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐氨嘧啶拌入飼料。5)建立免疫檔案，做好疫病監(jiān)測，定期對(duì)免疫豬進(jìn)行抗體檢測，并根據(jù)抗體水平高低及時(shí)加強(qiáng)免疫，一般每季度監(jiān)測1次，對(duì)各階段的豬群進(jìn)行采樣抗體監(jiān)測，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行免疫效果及疫情分析。

副豬嗜血桿菌的防治，需要加強(qiáng)主要病毒性疾病的免疫、選擇有效的藥物組合對(duì)豬群進(jìn)行常規(guī)的預(yù)防保健、改善豬群飼養(yǎng)管理等。對(duì)于副豬嗜血桿菌的治療應(yīng)從兩方面進(jìn)行，一是注射抗生素，通過藥敏試驗(yàn)篩選出敏感藥物，結(jié)合臨床情況，選擇合適藥物。二是副豬嗜血桿菌和其他的革蘭氏陰性菌一樣可以產(chǎn)生內(nèi)毒素，所以使用藥物時(shí)要充分考慮到內(nèi)毒素的影響，否則會(huì)出現(xiàn)使用藥物后，癥狀不但不減輕反而加重的情況，因此通過在飼料中添加對(duì)內(nèi)毒素有頡頏作用的黃芪多糖、淫羊藿等藥物[5]，以達(dá)到輔助治療的效果。

[1] 張盼鋒，仇微，劉宇，等． 副豬嗜血桿菌PCR快速診斷方法的建立[J]． 廣東畜牧獸醫(yī)科技 ，2009（1）：33-36．

[2] RAFIEE M， BARA M， STEPHENS C P ，e t a l．A p p l i c a t i o n o f ERIC PCR for the comparison of isolates of Haemophilus parasuis[J]． Australian Veterinary Journal，2001，78(12)：846-849．

[3] 譚瑤，趙清，舒為群，等．K-B紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床 ，2010，7（20）：2290-2291．

[4] 周雪瑞． 高致病性豬藍(lán)耳病及其防治[J]． 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) ， 2010， 49(5)：1153-1154．

[5] 王立新， 韓哲武． 黃芪多糖對(duì)內(nèi)毒素致小鼠毒性損傷的作用[J]． 藥學(xué)學(xué)報(bào)，1992， 27(1)：5-9．