一種含揮發(fā)油包合物的前期提取工藝研究

李春花+李佳佳+頓佳穎

[摘要] 目的 篩選最佳的揮發(fā)油包合物前期處理工藝。 方法 本研究以有機(jī)溶劑類型、有機(jī)溶劑的體積、提取時(shí)間為考察因素，以桂皮醛含量為評分指標(biāo)，采用水蒸氣蒸餾法提取包合物，通過L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝。色譜條件：程序升溫：90～180℃；進(jìn)樣量：1 μL，分流比為50：1。 結(jié)果 優(yōu)選的最佳工藝為選擇溶劑正丁醇，體積為2 mL，提取2 h。并且溶劑體積對本次實(shí)驗(yàn)有顯著性影響。 結(jié)論 優(yōu)選的最佳提取工藝通過驗(yàn)證科學(xué)可行，可廣泛應(yīng)用于包合物研究。

[關(guān)鍵詞] 包合物；揮發(fā)油；提取工藝；桂枝；桂皮醛

[中圖分類號] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（a）-0031-04

[Abstract] Objective To screen the best pretreatment technology of volatile oil inclusion compound. Methods The research on factors and the type of organic solvent， solvent volume， extraction time， the content of cinnamic aldehyde as the score index， inclusion extracted by steam distillation method， through L9（34） orthogonal test， the optimum extraction process. Chromatographic conditions： temperature programmed： 90-180℃； injection volume： 1 μL； split ratio was 50：1. Results The optimum process was the extraction of n-butanol， the volume was 2 mL， and the extraction time was 2 hours. And the volume of solvent had significant influence on this experiment. Conclusion The optimum extraction process is proved to be scientific and feasible， and it can be widely used in inclusion complex study.

[Key words] Inclusion compound； Volatile oil； Prophase treatment； Organic solvent； Cassia twig and cinnamaldehyde

揮發(fā)油也稱精油，是存在于植物中的一類具有揮發(fā)性、可隨水蒸氣蒸餾、與水不相混溶的油狀液體的總稱。揮發(fā)油大多具有芳香氣味，所以又稱為芳香油[1]。揮發(fā)油的生物活性多樣[2-5]，如具有止咳、平喘、祛痰、消炎、鎮(zhèn)痛和強(qiáng)心等作用。揮發(fā)油擁有如此之多的療效作用，在中藥制劑中應(yīng)用廣泛，目前揮發(fā)油多采用直接溶解噴灑或加入適當(dāng)增溶劑以制備成各種制劑。該法雖簡單易行，但穩(wěn)定性差，在存儲過程中隨時(shí)間的推移而散失，難以長期保存，應(yīng)用上有一定的局限性。而采用環(huán)糊精包合后形成包合物，增加了揮發(fā)油的溶解度、增加穩(wěn)定性、提高了揮發(fā)油的利用率，又可以使液體藥物粉末化，便于加工成其他劑型[6-9]。實(shí)驗(yàn)中若想控制包合物中揮發(fā)油質(zhì)量，需將其提取，定量，用氣相色譜儀來測定。如何有效地將包合于環(huán)糊精的揮發(fā)油提取出來，是包合物研究的一個(gè)關(guān)鍵共性問題。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

安捷倫7890B GC B.02.03.2（安捷倫科技公司），配備有SPH-300氫氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所），SPB-3全自動空氣源（北京中惠普分析技術(shù)研究所）；分析天平（上海精科儀器廠，TG328B）；LQ-A10002電子天平（上海樂祺精密電子廠）；KQ-100E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

桂枝購自安國藥材市場，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院侯芳潔老師鑒定符合2015版藥典一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定；無水硫酸鈉（分析純，深圳市中發(fā)源生物科技有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；石油醚（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；正丁醇（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；環(huán)己烷（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；β-環(huán)糊精（分析純，山東濱州化學(xué)試劑廠）；桂皮醛（批號：H02M6Q1，純度：98%，上海源葉生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的制備

稱取桂枝150 g，加8倍量的水，浸泡2 h，提取4 h，得到桂枝揮發(fā)油。將所收集的揮發(fā)油，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，在轉(zhuǎn)速3000 r/min的條件下離心6 min。即得桂枝揮發(fā)油。

2.2 包合物的制備

稱取β-環(huán)糊精（β-CD）10 g置燒杯中，加2倍量蒸餾水，使之完全溶解成環(huán)糊精的飽和溶液。取“2.1”項(xiàng)下制備的揮發(fā)油1 mL，用無水乙醇溶解（揮發(fā)油∶無水乙醇=1∶1，V/V），緩慢滴入具有一定溫度的β-CD溶液中，邊加邊研磨，滴完之后繼續(xù)人工研磨至規(guī)定時(shí)間后自然冷卻至室溫下，放入4 ℃冰箱冷藏24 h，抽濾，用無水乙醇洗滌3次，5 mL/次，至表面無揮發(fā)油殘留，并于40℃條件下真空干燥4 h，取出，即得干燥包合物。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)選包合物前期處理工藝

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，稱取包合物9份，選定有機(jī)溶劑（A）、有機(jī)溶劑的體積（B）、提取時(shí)間（C）為3個(gè)主要影響因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，采用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，按照本發(fā)明提供的方法提取包合物按桂皮醛的含量為評價(jià)指標(biāo)，通過氣相色譜進(jìn)行含量測定。因素水平表見表1。由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，3個(gè)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的大小順序依次為：B>C>A，即：溶劑體積>提取時(shí)間>溶劑選擇（表2）。方差結(jié)果表明，溶劑體積對本次實(shí)驗(yàn)有顯著性影響，結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果確定最佳提取工藝為：A3B3C2，即：選擇溶劑為正丁醇，體積為2 mL，提取2 h（表3）。endprint

2.4 GC測定桂皮醛含量的方法學(xué)考察

2.4.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫Hp-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），程序升溫：初始溫度90℃，保持2 min；以3℃/min的速率升至140℃，保持6 min；再以7℃/min的速率升溫至180℃，保持5 min；進(jìn)樣量：1 μL，分流進(jìn)樣，分流比為50∶1；載氣為N2，氫火焰離子化檢測器（FID）；進(jìn)樣口溫度為200℃，檢測器溫度為250℃；空氣流速390 mL/min，氫氣流速36 mL/min，尾吹15 mL/min，氮?dú)饬魉? mL/min[10-12]。見圖1。

2.4.2 對照品溶液的制備 取桂皮醛對照品適量，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得桂皮醛濃度為2.19 mg/mL的對照品溶液，備用。

2.4.3 供試品溶液的制備 取“2.2”項(xiàng)下包合物于圓底燒瓶中，加150 mL蒸餾水，混合均勻，水蒸氣蒸餾提取，在揮發(fā)油提取器上端加入一定量的有機(jī)溶劑，收集揮發(fā)油，提取結(jié)束后將有機(jī)溶劑補(bǔ)齊至原量，轉(zhuǎn)移置5 mL容量瓶中，加有機(jī)溶劑定容，得到供試品溶液。裝置見圖2。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取“2.4.2”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL，測定并記錄峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），含量（mg）為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得桂皮醛的線性回歸方程：Y=64706X+1.7498（R=0.9995，n=5），并在2.19～10.95 μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下的對照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積為1.0 μL，記錄色譜圖，計(jì)算得到目標(biāo)峰峰面積的RSD為1.45%（n=6）。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 照“2.4.3”制備供試品溶液，于配制后0、2、4、6、8、10 h注入氣相，按上述色譜條件進(jìn)行檢測，分別記錄桂皮醛的峰面積值，計(jì)算得到RSD為0.80%（n=6）。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批包合物共6份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件記錄桂皮醛的峰面積，并計(jì)算得到該樣品含量的RSD為1.00%（n=6）。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的供試品溶液9份，于10 mL容量瓶中，3份為一組，加入對照品溶液0.67、1.33、1.99 mL，甲醇定容，測定，得到桂皮醛的平均加樣回收率為97.96%，RSD值為1.27%（n=9）。具體數(shù)據(jù)見表4。

2.5 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

取桂枝揮發(fā)油包合物共3份，分別按最佳處理工藝A3B3C2進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)氣相測定，得到桂皮醛峰面積；將已知含量的揮發(fā)油進(jìn)行氣相測定，得到桂皮醛峰面積，與最佳處理工藝得到的結(jié)果進(jìn)行比較，可以得到濃度，從而進(jìn)一步計(jì)算得到提取效果。

按上述所確定的最佳工藝提取桂枝揮發(fā)油包合物3份，測定桂皮醛含量，比正交表9組實(shí)驗(yàn)中的桂皮醛含量都高，說明本次正交試驗(yàn)所篩選的工藝是合理、可行的，效果較好。見表5。

3 討論

葶藶生脈組方是全國名老中醫(yī)邢月朋根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出的治療氣虛血瘀、陽虛水停型CHF的經(jīng)驗(yàn)方，組方中的桂枝是辛溫解表藥，溫經(jīng)通絡(luò)，除痹止痛，又可走里，以溫中健脾化濕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，桂枝的有效成分桂皮醛具有抗炎、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、降糖、抗肥胖等多種藥理活性藥理作用[13-16]。因此本研究選用桂枝作為研究對象。

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)桂皮醛在氣相高效色譜的測定下十分敏銳。在氣相測定中，升溫速率與分流比對樣品分離有重要作用，升溫速率較大，分流比較小，使成分分離不徹底，分離度達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)；相反則會造成分離時(shí)間較長，浪費(fèi)時(shí)間。因此本研究采用先慢后快的方式進(jìn)行升溫，在第一階段以3℃/min的升溫速率，使得桂皮醛與其他成分有效分離，后階段以7 ℃/min的升溫速率，盡快達(dá)到一定高溫，以節(jié)省分析時(shí)間。

本研究提供一種含揮發(fā)油包合物的前期處理工藝及其相關(guān)參數(shù)，由于包合物中揮發(fā)油含量低，原來難以定量提出。使用該方法處理包合物，可以最大程度地提取得到揮發(fā)油，且工藝簡單，易于控制，使后期測定更加準(zhǔn)確可靠，利于實(shí)驗(yàn)研究。

本研究中針對有機(jī)溶劑的選擇原則為沸點(diǎn)高低、水溶性大小以及毒性強(qiáng)弱。經(jīng)了解，甲苯沸點(diǎn)為110.6℃，極微溶于水，但具有低毒性；甲酸乙酯雖無毒性，微溶于水，但沸點(diǎn)為53.4～54.4℃，較低；三氯甲烷有致癌可能性；乙酸乙酯沸點(diǎn)為77℃，溫度較低；正丁醇沸點(diǎn)為117.7℃，雖稍溶于水，但無毒性；環(huán)己烷沸點(diǎn)為80.7℃，雖有低毒，但不溶于水；石油醚雖為混合物，但溶解度較好，沸點(diǎn)有90～120沸程，因此選用后三者有機(jī)溶劑為研究對象。

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（收稿日期：2017-09-28 本文編輯：王 瓊）endprint