基于干旱脅迫下杉木轉錄組序列的EST-SSR分子標記開發(fā)1)

吳夏雷 董黎 孫宇涵 胡瑞陽 鄭會全 胡德活 李云

(北京林業(yè)大學，北京，100083) (中國林業(yè)科學研究院華北林業(yè)實驗中心) (廣東省林業(yè)科學研究院) (北京林業(yè)大學)

杉木(Cuiminghamialanceolata(Lamb.) HooK)是我國南方特有的多年生針葉用材樹種，距今已有3 000多年的栽培歷史，主要分布于我國秦嶺地區(qū)、長江流域以南以及臺灣山區(qū)，南北約跨10個緯度，東西約15個經度，海拔最高可達1 800 m以上[1]。杉木具有生長快、材性優(yōu)良的特點，是我國重要的商品材，用途廣泛[2]。近年來對杉木的研究多集中在雜交育種、良種繁育、材性提高等方面，而杉木的分子遺傳學研究基礎比較薄弱，早期開發(fā)出來的分子標記，因其標記缺乏共顯性、多態(tài)性不高、操作復雜等原因，很大程度上限制了杉木分子育種的發(fā)展，氣候環(huán)境的變化急需集合速生、抗逆等特性的新種質。

簡單重復序列(SSR)，又稱微衛(wèi)星，是重復序列為2～6 bp的單元，它們均勻分布于基因組中，是重復序列中主要組成部分之一[3-5]。簡單重復序列具有高度的保守性和專一性，可以特異地定位于染色體的某一位置，擴增所得產物可以在高分辨率的8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳加以分離，可以檢測出不同個體在每個SSR位點上遺傳結構的差異[6-7]。

SSR標記主要包括基于基因組序列開發(fā)的SSR標記(Genomic-SSR)和基于表達序列開發(fā)的SSR標記(EST-SSR)。據研究表明，相對于目前使用的大多數分子標記[8-11]，SSR標記具有多態(tài)性高、重復性好、共顯性遺傳等優(yōu)點，被廣泛應用于DNA指紋圖譜的構建、遺傳多樣性分析、分子標記輔助育種等方面[12]，但從基因組開發(fā)SSR標記，存在步驟繁雜、成本高、效率低等缺點。表達序列標記(EST)來源于基因的轉錄區(qū)，與功能基因緊密連鎖，能夠直接反映基因的表達信息，同時也避免了構建基因組DNA文庫等繁雜的步驟[13-14]。目前杉木已經開發(fā)得到的標記主要針對遺傳圖譜、核心種質資源構建、材性等經濟性狀，缺少與抗逆相關的標記。本試驗利用高通量測序技術獲得的干旱脅迫下杉木的轉錄組數據，結合毛細管電泳檢測技術，開發(fā)得到一組多態(tài)性較好的杉木EST-SSR標記，為今后杉木的遺傳多樣性分析、逆境脅迫響應等研究奠定了基礎。

1 材料與方法

杉木材料來自中國廣東的杉木良種基因型“GZ7”首先經組織培養(yǎng)擴繁得到組培苗，并種植于營養(yǎng)缽(營養(yǎng)缽底部直徑13 cm、高17 cm、上口直徑18 cm)，種植所用營養(yǎng)土由V(泥炭土)∶V(沙)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=3∶1∶1∶1的均勻混合而成。試驗以基因型“GZ7”15～20 cm高的1年生杉木組培苗為干旱脅迫處理材料。

SSR擴增所用材料取自2014年在中國廣東省龍山國家森林農場收集的300份杉木核心種質中大于0.02遺傳距離的24份種質，取當年生杉木嫩葉，液氮速凍后保存于冰箱中-80 ℃?zhèn)溆?。初篩引物所用的8份杉木種質隨機取自上述24份種質。

1.1 干旱脅迫處理

試驗所需的25株組培苗培養(yǎng)于北京林業(yè)大學人工氣候室，培養(yǎng)條件為70%相對濕度，25 ℃ 16 h光照與20 ℃ 8 h黑暗交替，光照強度為200～250 μmol·m-2·s-1。將25株的組培苗平均分為5組，包括正常澆水的5株苗作為對照，3個不同程度的干旱脅迫處理組(輕度、中度、重度)，和一個復水處理組。從對照及各個處理中隨機挑選3株組培苗，取頂端約5 cm長帶針葉莖段進行液氮速凍之后放到冰箱-80 ℃保存用于總RNA提取。

1.2 轉錄組測序

將對照及各處理的3株組培苗莖段在液氮中研磨成粉末，等量混合后提取總RNA。依據EASYspin植物RNA提取試劑盒使用說明抽提總RNA，總RNA質量經電泳及RNA完整度檢驗合格后進行轉錄組測序。

杉木轉錄組數據以二代高通量測序技術，在Solexa mRNA-Seq平臺上對試驗材料提取的總RNA進行測序[15]。使用CLC Genomics Workbench軟件(version:6.0.4)[16-18]對預處理后的杉木轉錄組數據進行從頭測序拼接，序列的質量控制參數為：字長=45，最小重疊長度≥300，得到初始非重復序列。再應用CAP3 EST拼接軟件對初始非重復序列進行第二次拼接，得到一個最終非重復序列集合。

1.3 EST-SSR挖掘和引物設計

用MISA軟件對得到的非重復序列進行EST-SSR分析，查找標準：二、三、四、五、六核苷酸的重復數分別大于6、5、5、5、5次；EST-SSR位點兩側序列長度≥50 bp。

隨機挑選120個EST-SSR，用Primer Premier 5軟件設計引物，并用Oligo 7進行驗證。引物設計時設置的主要參數為:GC含量40%～70%，退火溫度55～63 ℃，引物長15～30 bp，預期擴增產物長度200～400 bp，無二級結構和二聚體。

EST-SSR引物于2015年11月由北京睿博興科生物技術有限公司合成，并利用合適的熒光進行修飾得到可用于毛細管電泳檢測的熒光引物,引物用LX加序號命名，如LX-1。挑選遺傳距離較遠的8份杉木DNA樣品通過PCR擴增和8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對120對引物進行初步篩選。

1.4 PCR擴增及產物檢測

用大于0.02遺傳距離的24份杉木DNA材料進行PCR擴增，擴增混合物體系為20 μL，其中含有10 μL 2×2xTSINGKE?Master Mix(藍色)(北京擎科生物科技有限公司)，7 μL無RNase水，1 μL正向引物(含有熒光標記FAM和HEX)、1 μL反向引物和1 μL基因組DNA(30 ng/L)。PCR的程序如下：94 ℃預變性5 min，隨后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性30 s，55～63 ℃退火30 s(其中55～63 ℃是選擇其中最佳的退火溫度)，72 ℃下延伸30 s。最后，在72 ℃下延伸10 min，4 ℃保溫。所得擴增產物交由北京擎科生物科技有限公司進行毛細管電泳檢測。

1.5 數據統(tǒng)計與分析

利用GeneMarker V2.2.0軟件分析毛細管電泳結果，得到基因型數據(如果只擴增出1條帶，則按純合基因型處理)；利用Convert v1.31軟件轉換數據格式，用于后續(xù)分析；利用POPGEN v1.32軟件計算等位基因數；有效等位基因數；觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)性信息指數。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下杉木轉錄組序列拼接

對杉木轉錄組序列拼接結果進行統(tǒng)計(表1)，共得到75 357個片段重疊群，總長度65.29 Mb，平均長度867 bp，總序列的GC含量為39.4%。核苷酸長度在200～400 bp的片段重疊群數量最多，有24 948個，占總片段重疊群數的33.11%，其次是核苷酸長度在400～600 bp的片段重疊群數量，有19 633個，占總片段重疊群數的26.05%。拼接序列中最大拼接長度為26 392 bp，N75長度為552 bp，N50長度為1 289 bp，N25長度為2 430 bp。

2.2 干旱脅迫下杉木轉錄組中EST-SSR位點的分布特點

在轉錄組共75 357條非重復序列中有7 326個潛在EST-SSR位點，分布頻率(與總非重復序列數量之比)為9.72%，其中單核苷酸型位點有4 943個。在總計2 383個復合型和二、三、四、五、六核苷酸重復類型的EST-SSR中，復合型有384個，二、三、四、五、六核苷酸重復類型分別有925、982、67、11、14個，平均長度分別為15.70、16.96、22.85、25.45、31.71、60.37 bp。杉木轉錄組序列中平均47.66 kb就能發(fā)現(xiàn)1個EST-SSR位點，在2 383個EST-SSR位點中共包含525種重復單元，復合型、二、三、四、五、六核苷酸重復類型EST-SSR分別有384、11、61、44、11、14種，其中復合型、五、六核苷酸重復類型EST-SSR每種重復單元的數量只有1個(表2)。出現(xiàn)頻率最高的重復單元類型是AT/TA(453次)，占總EST-SSR的19.01%，其次是AG/TC(149次)，占總EST-SSR的6.25%，同時，在二核苷酸重復類型中還發(fā)現(xiàn)了少量的CG重復(2次)。

表1 杉木轉錄組CLC拼接結果

干旱脅迫下杉木轉錄組中主要的EST-SSR重復類型中，三核苷酸和二核苷酸重復類型數量最多，分別占總EST-SSR數的41.21%和38.82%；復合型EST-SSR也較多，占總EST-SSR數的16.11%；四、五、六核苷酸重復類型EST-SSR數量很少，總計占3.86%。

表2 杉木錄組中EST-SSR重復單元的分布特征

2.3 干旱脅迫下杉木轉錄組EST-SSR標記的多態(tài)性分析

以8份杉木DNA樣品為模板進行PCR擴增，通過8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對120對引物初步篩選，部分電泳結果如圖1所示，挑選電泳條帶好的引物，初選出24對引物用24個杉木DNA樣品進行毛細管電泳檢測，結果發(fā)現(xiàn)在24對引物中有23對引物檢測出特異性峰(以引物LX-18為例(圖2))，只有1對引物沒有檢測出特異性峰。

M.DL100 DNA Marker;編號1～8的為引物LX-18，編號9～16的為引物LX-19，編號17～24的為引物LX-20；編號25～32的為引物LX-21。

圖2 引物LX-18多態(tài)性峰

在24份杉木樣品中共檢測到94個等位基因，等位基因變異數范圍為2～9個，平均每個位點有4.087 0個，其中，引物LX-21、LX-77、LX-84、LX-87最少；LX-18、LX-47最多，有6對引物的等位基因數介于5～9個，9對引物的等位基因數為3個及以下；有效等位基因數范圍為1.086 8(LX-77)～6.914 3(LX-47)個，平均有效等位基因數2.089 0個；觀測雜合度范圍為0.250 0(LX-66)～1.000 0(LX-84)，平均0.648 7；期望雜合度范圍為0.082 4(LX-79)～0.896 1(LX-47)，平均0.429 0；多態(tài)性信息指數范圍是0.173 2(LX-77)～2.035 3(LX-47)，平均0.809 0，說明所開發(fā)的EST-SSR具有很高的多態(tài)性(表3)。

表3 23對EST-SSR引物在24份杉木樣品中的多態(tài)性結果

3 結論與討論

在干旱脅迫下杉木的轉錄組中，EST-SSR分布的頻率較高，為9.72%，高于火炬松(Pinustaeda)的1.2%，海岸松(Pinuspinaster)的2.1%，日本落葉松(Larixkaempferi)的3.85%[19-20]，其平均分布距離為47.66 kb。在EST-SSR重復類型中，復合型和二、三、四、五、六核苷酸重復類型都有出現(xiàn)，其中三核苷酸重復類型EST-SSR最多，有982個，占總EST-SSR的41.21%，很多谷類作物如小麥、水稻的EST-SSR研究中也是這種情況[21-22]。在二核苷酸重復單元中AT/TA(占總EST-SSR的19.01%)占主導地位，同時也發(fā)現(xiàn)了2次CG重復，表現(xiàn)出了明顯的偏倚性。值得注意的是，在干旱脅迫下杉木轉錄組中出現(xiàn)的復合型EST-SSR較多，有384個，占EST-SSR總數的16.11%，且復合模式多為三核苷酸與三核苷酸復合或三核苷酸與六核苷酸復合，這可能與生物的信使RNA分子上3個堿基決定1個氨基酸的模式有關，EST序列位于基因的編碼區(qū)，與功能基因緊密連鎖，且EST-SSR在生物適應性進化中起著重要的調控作用[23-25]，植物對逆境的應答反應或許很大程度上受EST-SSR變異的調控。本試驗中，豐富的EST-SSR標記說明杉木可能以這些標記所對應的基因的變異來適應干旱脅迫。

毛細管電泳技術可以一次獲得多個位點的多態(tài)性信息，具有效率高、成本低、產率高等優(yōu)點[26]，可以利用該技術提高轉錄組中大量的多態(tài)性位點的選擇效率。本試驗中，通過8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳初選出的24對引物，用24個杉木DNA樣品進行毛細管電泳檢測后發(fā)現(xiàn)有23對引物能夠穩(wěn)定擴增出有多態(tài)性的目的片段，只有1對引物的擴增產物無多態(tài)性，這可能是該引物附近的序列復雜性比較低，也有可能是引物所在序列屬于多基因家族所致。在23對具有多態(tài)性的引物中，引物LX-18、LX-47的等位基因變異數(Na)最多(9個)，且這兩個引物的重復類型都為三核苷酸重復，驗證了低級重復單元SSR的多態(tài)性普遍比高級重復單元高的推斷[27]，因此在設計SSR引物時盡量多選擇含低級重復單元的序列。

在杉木的遺傳改良過程中，利用EST-SSR對種子園內花粉種類、花粉量的大小及其分布的進行監(jiān)測，從而有效地提高種子園的經營管理水平。EST-SSR分子標記也具有高可靠性的品種間鑒別能力，通過構建主栽品種的EST-SSR分子標記數據庫和設置合理的品種鑒別相似性閾值，能夠有效的排除品種內變異對分類鑒定結果的干擾，更加客觀和準確的對品種進行分類和鑒別。在林木育種中，EST-SSR標記的應用可以起到加快育種進程、提高選擇效率的作用。試驗得到的一組杉木EST-SSR分子標記為研究杉木的遺傳多樣性、種群結構、DNA指紋數據庫構建和遺傳信息的保存提供了基礎，對杉木遺傳結構的演化方式及方向、遺傳改良策略的研究也具有重要意義。

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