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    響應(yīng)面法優(yōu)化馬齒莧黃酮超聲波提取工藝

    2018-03-07 06:51:03張曉艷呂德雅
    關(guān)鍵詞:面法馬齒莧液料

    王 波, 張曉艷, 黃 攀, 呂德雅, 嚴(yán) 帆, 劉 輝

    (安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241002)

    馬齒莧(PortulaceoleraceaL.)是馬齒莧科馬齒莧屬一年生肉質(zhì)草本植物,又名螞蟻菜、長(zhǎng)命菜、瓜子菜、五行草等,在中國(guó)南北方均有分布,資源十分豐富[1-3]。馬齒莧含有黃酮、多糖、多酚、生物堿等多種生物活性物質(zhì),具有廣泛的藥理活性及營(yíng)養(yǎng)保健功能[4-7],是中國(guó)衛(wèi)生部劃定的101種藥食同源野生植物之一,曾經(jīng)被列入2008年北京奧運(yùn)會(huì)的菜譜[8-9],對(duì)馬齒莧功能性成分的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。黃酮類(lèi)化合物具有較低的毒性和廣譜的藥學(xué)功能,具有抗腫瘤、抗過(guò)敏、抗菌、抗病毒、抗衰老、降低心肌耗氧量、降血糖及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能[10-11]。近年來(lái),對(duì)于馬齒莧黃酮的研究,主要涉及提取工藝[12-14]、抑菌和抗氧化性等方面[15-17],但目前未見(jiàn)利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化馬齒莧黃酮提取工藝方面的報(bào)道。響應(yīng)面分析法通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型解決受多種因素影響的最優(yōu)組合問(wèn)題,用于確定各因素及其交互作用在工藝過(guò)程中對(duì)響應(yīng)值的影響,常用于原料功效成分提取工藝條件的優(yōu)化[18-21]。超聲波提取技術(shù)具有快速、廉價(jià)和高效的特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于多種天然產(chǎn)物的提取[22]。本研究采用超聲波法提取馬齒莧黃酮,并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝,為馬齒莧植物資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 馬齒莧樣品

    馬齒莧樣品2015年10月15日采于安徽省安慶市潛山縣。新鮮馬齒莧先用自來(lái)水沖洗掉泥沙,然后用蒸餾水沖洗干凈,最后用濾紙迅速吸干表面附著水分,于90 ℃條件下殺青30 min,60 ℃下烘干至恒質(zhì)量。烘干后的馬齒莧樣品用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60目尼龍篩,分別存于自封袋中編號(hào)備用。

    1.2 儀器與試劑

    主要儀器:752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品),KH3200E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品),SHZ-D(Ш)型循環(huán)水式真空泵(上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品)。

    主要試劑:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,亞硝酸鈉,硝酸鋁,氫氧化鈉,無(wú)水乙醇,以上試劑均為分析純。

    1.3 馬齒莧黃酮超聲波提取工藝

    準(zhǔn)確稱取已過(guò)60目篩的馬齒莧干燥樣品1.000 0 g,進(jìn)行超聲波提取,然后過(guò)濾,最后將濾液定容至50 ml,即得馬齒莧黃酮提取液。

    1.4 馬齒莧黃酮提取率的測(cè)定

    精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.008 0 g,加60%乙醇溶解,轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中并稀釋至刻度,搖勻,即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液[21]。分別移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 ml至10只10 ml容量瓶中,加入60%乙醇溶液補(bǔ)充至5.0 ml。先分別加入5%NaNO2溶液0.3 ml搖勻,放置6 min后,分別加入10% Al(NO3)3溶液0.3 ml搖勻,放置6 min后,再分別加入1.0 mol/L NaOH溶液4.0 ml,用蒸餾水定容至10.0 ml搖勻,放置15 min后,在510 nm處測(cè)定吸光度值[23]。以吸光度值為縱坐標(biāo),黃酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是Y=18.419 0x+0.012 6,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。精密移取馬齒莧黃酮提取液1.5 ml至10 ml容量瓶中,同上操作加入5%NaNO2、10% Al(NO3)3和1.0 mol/L NaOH,定容,在510 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)測(cè)得的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算馬齒莧中黃酮的含量,然后計(jì)算馬齒莧黃酮提取率,馬齒莧黃酮提取率=(馬齒莧黃酮質(zhì)量/馬齒莧質(zhì)量) ×100%。

    1.5 馬齒莧黃酮提取的單因素試驗(yàn)

    前人研究結(jié)果表明,在黃酮的超聲波輔助提取過(guò)程中,黃酮提取率受乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取溫度等提取工藝參數(shù)的影響[20,24]。因此,分別以這4個(gè)工藝參數(shù)為單因素進(jìn)行試驗(yàn),研究其對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響,各因素水平見(jiàn)表1。

    1.6 馬齒莧黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,采用4因素3水平對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn),同時(shí)采用Design-Expert.V8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面分析,確定超聲波法提取馬齒莧黃酮的最優(yōu)工藝。試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

    表1馬齒莧黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

    Table1FactorsandcodedlevelsofresponsesurfaceanalysisforextractingflavonoidfromPortulaceoleraceaL.

    水平乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)液料比(ml/g)提取時(shí)間(min)提取溫度(℃)-16010∶1405007020∶1606018030∶18070

    1.7 統(tǒng)計(jì)分析

    試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù),采用SPSS 17.0 for Windows 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用origin86軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 馬齒莧黃酮提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響 控制反應(yīng)條件為液料比 30∶1(ml/g),反應(yīng)溫度50 ℃,提取時(shí)間60 min,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%、100%時(shí)的黃酮提取率。由圖1可知,黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí),黃酮提取率達(dá)到最大值(1.16%)。再增大乙醇體積分?jǐn)?shù),黃酮提取率反而下降。這可能是由于隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大黃酮類(lèi)化合物的溶解度也隨之增大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)樣品中的其他醇溶性物質(zhì)被浸出,與黃酮形成競(jìng)爭(zhēng)[20],從而導(dǎo)致黃酮提取率降低。因此確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

    圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on flavonoid extraction yield

    2.1.2 液料比對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響 控制反應(yīng)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,反應(yīng)溫度50 ℃,提取時(shí)間60 min,考察液料比分別為 5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 (ml/g)時(shí)的黃酮提取率。由圖2可知,黃酮提取率隨液料比的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)液料比為 20∶1時(shí),黃酮提取率達(dá)到最大值(1.36%)。如果溶劑用量少,則黃酮溶出量少;如果溶劑用量過(guò)大,雜質(zhì)溶出量也增加,且成本增加[22]。因此確定最佳液料比為 20∶1。

    圖2 液料比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ratio of liquid-to-solid on flavonoid extraction yield

    2.1.3 提取時(shí)間對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響 控制反應(yīng)條件為液料比 30∶1(ml/g),乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,反應(yīng)溫度50 ℃,考察超聲波提取時(shí)間分別為20 min、40 min、60 min、 80 min、100 min及120 min時(shí)的黃酮提取率。由圖3可知,黃酮提取率隨提取時(shí)間的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí),黃酮提取率達(dá)到最大值(1.44%)。提取時(shí)間較短時(shí)黃酮沒(méi)有完全溶出,當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)溶出的黃酮可能被氧化分解掉,使得提取率下降。因此,確定最佳提取時(shí)間為60 min。

    圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on flavonoid extraction yield

    2.1.4 提取溫度對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響 控制反應(yīng)條件為液料比 30∶1(ml/g),乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,提取時(shí)間60 min,考察反應(yīng)溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃ 時(shí)的黃酮提取率。由圖4可知,黃酮提取率隨提取溫度的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí),黃酮提取率達(dá)到最大值(1.44%)。這種變化主要是由于溫度在一定范圍內(nèi)升高時(shí),物質(zhì)的溶解度會(huì)增加,分子間的黏滯度下降,使得更多的黃酮得以溶出。但過(guò)高的溫度會(huì)破壞黃酮的分子結(jié)構(gòu),從而降低黃酮的提取率[25]。因此,確定最佳提取溫度為60 ℃。

    圖4 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on flavonoid extraction yield

    2.2 馬齒莧黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 回歸模型的建立和方差分析 采用Design-Expert V8.0.6.1軟件,根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、提取時(shí)間(C)、提取溫度(D)4因素作為自變量,以馬齒莧黃酮提取率作為響應(yīng)值,共設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),其中24個(gè)分析點(diǎn),5個(gè)零點(diǎn)[26-28]。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及數(shù)據(jù)處理結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,建立四元二次響應(yīng)面回歸方程(編碼方程):黃酮提取率=1.300 0-0.009 2A+0.130 0B+0.013 0C+0.013 0D+0.042 0AB-0.020 0AC-0.020 0AD+0.050 0BC-0.043 0BD+0.040 0CD-0.000 3A2-0.057 0B2-0.059 0C2-0.046 0D2。

    表2Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值

    Table2Box-Behnkenexperimentaldesignandcorrespondingresults

    試驗(yàn)號(hào)因素水平乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)液料比(B)提取時(shí)間(C)提取溫度(D)黃酮提取率(%)11-1001.052-1-1001.20300001.37401011.305-11001.326100-11.3070-1100.97800001.319-100-11.20100-10-10.991101101.41120-1-101.1113-10-101.1814010-11.301511001.3416-10101.331710-101.171800-1-11.251900111.192000-111.102100001.2522-10011.302300001.312401-101.352500001.262610101.2427001-11.182810011.32290-1011.16

    表3響應(yīng)面二次回歸方程各項(xiàng)與黃酮提取率的方差分析

    Table3Analysisofvarianceforeachtermoftheresponsesurfacequadraticregressionequationandtheextractionrateofflavonoid

    項(xiàng)目平方和自由度均方差F值P值模型0.280140.0204.500.0040**A0.00110.0010.220.6429B0.20010.20044.18<0.0001**C0.00210.0020.480.4993D0.00210.0020.440.5178AB0.00710.0071.610.2253AC0.00210.0020.360.5601AD0.00210.0020.360.5601BC0.01010.0102.200.1597BD0.00810.0081.690.2152CD0.00610.0061.430.2524A20.00010.00000.9913B20.02110.0214.680.0483*C20.02310.0235.010.0419*D20.01410.0143.030.1037殘差0.063140.004失擬項(xiàng)0.054100.0052.330.2150純誤差0.00940.002總離差0.35028

    A:乙醇體積分?jǐn)?shù);B:液料比;C:提取時(shí)間;D:提取溫度。*、**分別表示該項(xiàng)目對(duì)黃酮提取率的影響顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01),R2=0.818 2。

    響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果(表3)顯示:失擬項(xiàng)不顯著(P=0.215 0>0.05),說(shuō)明模型的擬合程度良好,殘差均由隨機(jī)誤差引起,未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小[29];模型的P值為0.004 0,表明該二次方程模型為極顯著[30];四元二次響應(yīng)面回歸方程的決定系數(shù)R2=0.818 2,說(shuō)明回歸方程擬合性好。綜上所述,該二次響應(yīng)面回歸方程的失擬項(xiàng)很小,模型極顯著,試驗(yàn)誤差小,說(shuō)明模型擬合非??煽浚虼丝捎迷摶貧w方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[31]。

    根據(jù)模型擬合結(jié)果,馬齒莧黃酮最佳提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、液料比 30∶1 (ml/g)、提取時(shí)間55.40 min、提取溫度64.19 ℃,此條件下馬齒莧黃酮提取率為1.42%。為方便操作,將馬齒莧黃酮最佳提取工藝參數(shù)修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、液料比30∶1(ml/g)、提取時(shí)間55 min、提取溫度64 ℃。在此最佳提取工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),3次重復(fù),結(jié)果表明馬齒莧黃酮的提取率為1.38%,接近模型預(yù)測(cè)的馬齒莧黃酮提取率,說(shuō)明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值之間具有較好的擬合性,從而也證明了響應(yīng)面分析法優(yōu)化馬齒莧黃酮提取工藝的可行性。

    2.2.2 馬齒莧黃酮提取的響應(yīng)面分析 由乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)馬齒莧黃酮提取率所構(gòu)成的響應(yīng)圖,可反映兩因素交互作用對(duì)黃酮提取率的影響。固定2個(gè)因素在0水平上,分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取溫度交互作用對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響。根據(jù)回歸分析結(jié)果,采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件作出響應(yīng)曲面圖(圖5)。響應(yīng)曲面圖中,曲線走勢(shì)越陡,影響越顯著;曲線走勢(shì)越平滑,影響越小[32]。由圖5可知:液料比對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響最為顯著,表現(xiàn)為曲線較陡,其次為提取時(shí)間和提取溫度,影響最不顯著的是乙醇體積分?jǐn)?shù),表現(xiàn)為曲線較為平滑,隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化,馬齒莧黃酮提取率的變化較小。

    圖5 各因素間交互作用對(duì)黃酮提取率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of cross-interactions among different factors on the extraction rate of flavonoid

    3 結(jié) 論

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert,對(duì)自變量乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取溫度4因素與因變量黃酮提取率的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行了回歸分析,得到的數(shù)學(xué)模型擬合性好,表明該模型準(zhǔn)確可靠,能夠用該模型代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)馬齒莧黃酮的最佳提取條件及其理論最大提取率。根據(jù)數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)出的試驗(yàn)條件和實(shí)際操作的可行性,確定馬齒莧黃酮最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、液料比30∶1(ml/g)、提取時(shí)間55 min、提取溫度64 ℃,此條件下馬齒莧黃酮提取率為1.38%,與預(yù)測(cè)值1.42%相差較小。

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