番鴨IGF-I基因克隆及其在肌肉組織發(fā)育中的表達(dá)規(guī)律

董 飚, 王 健, 段修軍, 孫國波

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

采用性狀獨立淘汰法、綜合指數(shù)法等傳統(tǒng)的育種方法使畜禽生產(chǎn)性能得到了較大幅度的提升，但是生產(chǎn)性能到達(dá)一定水平后很難繼續(xù)取得較大成效。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)和快速發(fā)展，一些基因的功能得到了驗證，基于功能基因的現(xiàn)代育種手段可以快速、有效地提升畜禽生產(chǎn)性能。畜禽動物的生長受到神經(jīng)內(nèi)分泌生長軸的調(diào)控，其中起主導(dǎo)作用的是下丘腦-垂體-靶器官途徑，此生長軸涉及胰島素樣生長因子、肌肉生長抑制因子、生長激素及其受體等一些功能基因。

胰島素樣生長因子(insulin like growth factors，IGF)最先在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，其介導(dǎo)生長激素的促生長作用，與胰島素許多結(jié)構(gòu)高度相似，能與胰島素受體競爭性結(jié)合，有類似胰島素的作用，因此獲得其名稱。胰島素樣生長因子-I(IGF-I)是胰島素樣生長因子家族成員之一，是細(xì)胞生長增殖的調(diào)控信號之一，對機(jī)體細(xì)胞增殖、分化具有重要調(diào)控作用，在畜禽生長過程中發(fā)揮調(diào)控瘦肉率的作用。IGF-I基因在組織中的表達(dá)量和其功能有著密切的關(guān)系，對其進(jìn)行研究具有重要的意義。在對大圍山微型雞、武定雞和艾維茵肉雞的研究中發(fā)現(xiàn)，雞肝臟中IGF-I基因的表達(dá)量與體質(zhì)量、體尺呈顯著正相關(guān)[1]。在孵化13 d的鴨胚肝臟組織中就可以檢測到IGF-I基因的mRNA表達(dá)，在早期生長發(fā)育過程中肝臟組織中IGF-I基因mRNA表達(dá)量與體質(zhì)量的變化趨勢一致，呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)[2]。同樣，IGF-I在鴨肝臟組織中表達(dá)量有特定的發(fā)育模式且在品種之間存在差異[3]。在孵化7～17 d的雞、鵪鶉及雜交后代胚胎肌肉中就可以檢測到IGF-I基因mRNA表達(dá)，在孵化10 d時達(dá)到第一次峰值，孵化 15～16 d時達(dá)到第二次峰值，而且IGF-I基因mRNA表達(dá)規(guī)律與成肌細(xì)胞增殖和肌管融合規(guī)律一致[4]。雞胚胎孵化中期(孵化9 d和孵化13 d)腿部肌肉組織IGF-I基因mRNA表達(dá)量顯著高于孵化后期(孵化20 d)，這可能與胚胎腿部肌肉的發(fā)育速度有關(guān)，中期發(fā)育速度較快，后期發(fā)育速度相對遲緩[5]。高郵鴨和金定鴨胚胎胸肌和腿肌成肌細(xì)胞中IGF-I基因mRNA表達(dá)規(guī)律基本一致[6]。在家禽胚胎期和早期生長發(fā)育過程中，IGF-I基因在組織中的表達(dá)研究已經(jīng)取得一定的成績。

在家禽生長發(fā)育過程中，IGF-I基因在肌肉組織中又是如何表達(dá)的。鑒于此，本研究根據(jù)GenBank上公布的禽類IGF-I基因序列設(shè)計引物，通過克隆、測序獲得番鴨IGF-I基因序列，并采用生物學(xué)軟件進(jìn)行分析。同時采集番鴨早期第2、4、6、8、10、13周齡的肌肉組織，采用實時熒光定量PCR方法檢測IGF-I基因在番鴨肌肉生長過程中的mRNA表達(dá)規(guī)律，為開展IGF-I基因功能研究增加資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在番鴨2、4、6、8、10、13周齡時，各個時期末隨機(jī)抽取10只鴨，公母各半。屠宰放血后，采集胸肌、腿肌組織置于液氮速凍，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設(shè)計 根據(jù)GenBank中公布的禽類IGF-I基因序列，用DNAMAN軟件尋找該基因保守區(qū)并設(shè)計引物，引物由上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。引物序列及信息見表1，其中引物A1是用于IGF-I基因克隆，A2、A3分別用于實時熒光定量PCR時用于擴(kuò)增IGF-I、β-actin基因。

表1基因克隆和mRNA表達(dá)所用引物信息表

Table1ThebasicinformationofprimersusedingenecloningandmRANexpression

引物名稱 引物序列(5'→3')擴(kuò)增產(chǎn)物(bp)退火溫度(℃)A1F:TGCCCTCAACATCTCA-CATC56355R:TGGCACATTCATTCT-TCATTCTA2F:TGCTTCCAGAGTTGTGAC-CT15660R:TCCTGTGTTCCCTCTACT-TGA3F:CTATGTCGCCCTG-GATTTCG14760R:AAAGATGGCTG-GAAGAGGGC

1.2.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用Trizol試劑提取肌肉組織中總RNA，用核酸濃度測定儀檢測RNA濃度和純度，并用瓊脂糖凝膠快速電泳檢測RNA的質(zhì)量。檢測完成按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，以適量RNA為模板、Oligo(DT)為引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。

1.3 PCR擴(kuò)增

以cDNA為模板，引物A1進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得IGF-I片段。PCR反應(yīng)體系為25 μl：10×PCR 緩沖液 (無Mg2+) 2.5 μl，dNTP (2.5 mmol/L)2.0 μl，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，上、下游引物 (10 μmol/L)各 1.0 μl，Taq聚合酶 (5 U/μl) 0.2 μl，cDNA模板 1.0 μl，dH2O 16.8 μl。

1.4 克隆測序

將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5-α中，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)12 h。隨機(jī)挑取菌落，用菌液PCR法和酶切質(zhì)粒法篩選陽性克隆，每對引物挑選2個陽性克隆送上海桑尼生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

反應(yīng)體系為：UltraSYBR Mixture (2×) 10.0 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μl，模板 2.0 μl，加入滅菌蒸餾水至20.0 μl。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計分析

基因測序結(jié)果用NCBI上的BLAST進(jìn)行序列比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.BLAST/)，序列的翻譯和不同物種之間序列進(jìn)化關(guān)系作圖用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行分析。不同組別之間基因表達(dá)差異性采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 IGF-I基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

取任意1個番鴨胸肌組織提取總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以引物A1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物處于 500～750 bp，與預(yù)期的結(jié)果較為相似，初步斷定其可能是IGF-I基因的序列。

1：分子量標(biāo)準(zhǔn)，DL2000；2、3：引物A1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 番鴨IGF-I基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of IGF-I gene PCR products about Muscovy duck

2.2 序列分析結(jié)果

通過克隆測序獲得563 bp的cDNA序列(圖2)。運(yùn)用軟件分析發(fā)現(xiàn)這段序列包括了91 bp的5′端、462 bp的編碼區(qū)、10 bp的3′端，編碼153個氨基酸。

圖2 番鴨IGF-I基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequence of IGF-I gene on Muscovy duck

2.3 物種間序列同源性比較

不同物種之間IGF-I基因編碼區(qū)核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列同源性見表2、表3。由表2可知，番鴨與野鴨(EU031044)、鵝(DQ662932)、雞(FJ977570)、人(NM_000618)、小鼠(NM_001111275)、牛(HQ324241)、豬(JX827417)等物種IGF-I基因核苷酸序列同源性達(dá) 76.8%～99.1%，其中與鵝同源性最高，與小鼠的同源性最低。由表3可知，番鴨與野鴨、鵝、雞的氨基酸序列同源性較高，均在98.7%以上，與小鼠、牛、豬的同源性為 77.8%～83.7%。

表2不同物種IGF-I基因核苷酸序列的相似性

Table2SimilaritycomparisonofnucleotidesequenceofIGF-Igeneindifferentanimals

動物相似度(%)番鴨野鴨鵝雞人小鼠牛野鴨98.9鵝99.199.4雞98.198.398.1人80.580.781.080.7小鼠76.876.876.877.388.7牛79.479.979.980.193.586.8豬80.380.780.780.793.588.394.4

表3不同物種IGF-I基因編碼的氨基酸序列的相似性

Table3SimilaritycomparisonofaminoacidsequenceofIGF-Igeneindifferentanimals

動物相似度(%)番鴨野鴨鵝雞人小鼠牛野鴨98.7鵝99.399.3雞98.798.799.3人83.783.083.784.3小鼠77.877.177.877.891.5牛83.082.483.083.796.190.2豬83.783.083.784.396.190.298.0

根據(jù)IGF-I基因編碼的氨基酸序列同源性構(gòu)建關(guān)系樹(圖3)，主要分為兩大類，一類是番鴨、野鴨、鵝和雞禽類聚在一起，另外一類是哺乳動物聚在一起，其中豬和牛先聚在一起，然后再與人、小鼠聚在一起。

圖3 不同物種IGF-I基因編碼的氨基酸序列同源關(guān)系樹Fig.3 Homologous relationship tree of IGF-I gene amino acid sequence in different animals

2.4 肌肉組織IGF-I基因mRNA表達(dá)

本試驗采用qRT-PCR方法檢測了番鴨生長過程中IGF-I基因在胸、腿肌組織中mRNA表達(dá)規(guī)律，詳細(xì)見表4。在公鴨胸肌組織中，第2周齡IGF-I基因mRNA表達(dá)量顯著性高于其他周齡；第6、8、10周齡間基因mRNA表達(dá)量無顯著性差異，均顯著性高于第4、13周齡；第4、13周齡間表達(dá)量無顯著差異。在母鴨胸肌組織中，同樣第2周齡表達(dá)量顯著性高于其他周齡；第6、8周齡間表達(dá)量無顯著差異，顯著性高于第4、10、13周齡；第4、10、13周齡間表達(dá)量無顯著差異。

在公鴨腿肌組織中，第2周齡IGF-I基因mRNA表達(dá)量最高，顯著性高于其他周齡；第8、10周齡間表達(dá)量無顯著性差異，顯著性高于第4、6、13周齡；第6、13周齡間表達(dá)量無顯著性差異，顯著性高于第4周齡。在母鴨腿肌組織中，第2周齡IGF-I基因mRNA表達(dá)量最大，顯著高于其他周齡；第13周齡表達(dá)量顯著高于第4、6周齡，第4、6、10周齡間表達(dá)量無顯著差異。

在肌肉組織中IGF-I基因mRNA的表達(dá)量均表現(xiàn)為第2周齡最高，然后下降，在第4周齡出現(xiàn)最低點，不同性別、組織中回升的速度不同，在最后階段，除母鴨腿肌外，其他肌肉組織中IGF-I基因mRNA表達(dá)量再次下降。

表4番鴨不同時期IGF-I基因表達(dá)量

Table4IGF-IgeneexpressionofMuscovyduckatdifferentstages

周齡公鴨胸肌腿肌母鴨胸肌腿肌20.74±0.11a0.46±0.04a1.14±0.14a0.28±0.09a40.24±0.04c0.13±0.02d0.16±0.03c0.02±0.01c60.52±0.02b0.21±0.02c0.74±0.03b0.05±0.01c80.61±0.04b0.33±0.03b0.71±0.05b0.07±0.02bc100.61±0.04b0.34±0.04b0.17±0.03c0.09±0.02bc130.21±0.03c0.24±0.04c0.21±0.02c0.14±0.02b

同一列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.0.5)。

3 討 論

隨著人類基因組計劃的順利實施完成，生物技術(shù)的快速發(fā)展，測序效率的提升，成本的降低等，促進(jìn)了其他動物基因組測序工作。動物基因組測序結(jié)果有利于開展相關(guān)基因后續(xù)研究工作。在禽類，雞的基因組序列早已公開，鴨和鵝基因組測序工作已經(jīng)結(jié)束，但是序列未公開發(fā)布。本試驗對番鴨IGF-I基因進(jìn)行克隆和序列分析，獲得了1個cDNA序列，其中編碼區(qū)序列包括了462 bp，編碼153個氨基酸，番鴨與野鴨、鵝、雞IGF-I基因核苷酸序列的同源性比較高，在98.1%以上，而與人和哺乳動物的同源性在80%左右，物種間的進(jìn)化關(guān)系結(jié)果表明鴨IGF-I基因的功能與其他家禽更為相似。

IGF-I是一種高效能因子，通過影響動物蛋白沉積、肌細(xì)胞增殖、成肌細(xì)胞分化以及肌管融合等方式促進(jìn)動物骨骼肌生長發(fā)育[7]。史旭升等[8]在28日齡、56日齡鵝的胸肌、腿肌組織中均可以檢測到IGF-I基因mRNA表達(dá)，且28日齡的肌肉中表達(dá)量要高于56日齡，這說明IGF-I基因可能參與調(diào)控鵝肌肉的生長發(fā)育。Serrano等[9]在第12-16 d的雞胚大腦、胰腺組織中可以檢測到IGF-I基因mRNA的表達(dá)，在肝臟中沒有檢測到，出殼后肝臟組織中IGF-I基因的mRNA表達(dá)量才逐漸升高，說明胚胎期間所有的IGF-I均來自肝外組織。Richards等[10]發(fā)現(xiàn)火雞孵化第14 d就可以在腦和肝臟組織中檢測到IGF-I基因mRNA表達(dá)，但是在整個孵化期間IGF-I基因mRNA表達(dá)量都比較低，在出殼后快速上升，第3周齡時組織中IGF-I基因表達(dá)量是胚胎期的8倍，腦組織中IGF-I基因mRNA表達(dá)量比肝臟組織中高，而且腦組織中的表達(dá)量隨著生長逐步上升，在3周齡時達(dá)到最高值。試驗結(jié)果顯示，肌肉組織中IGF-I基因mRNA表達(dá)量在第2周齡最高，這與Yun等在肉雞上的研究結(jié)果[11]較為相似。但是番鴨在第4～6周齡時表達(dá)量出現(xiàn)了反彈現(xiàn)象，這又與在雞上的表達(dá)存在差異，說明IGF-I基因在家禽早期生長發(fā)育過程所起的作用是相似的，但是會受到物種因素的影響而不同。公番鴨胸肌組織中IGF-I基因mRNA表達(dá)量在第8～10周齡出現(xiàn)下降，而母鴨在10～13周齡出現(xiàn)下降；公鴨腿肌組織中IGF-I基因mRNA表達(dá)量在第10周齡出現(xiàn)反彈高峰，而母鴨在13周齡還在反彈。IGF-I基因在公、母鴨肌肉組織中表達(dá)規(guī)律的差異可能與公、母番鴨的生長速度不同有關(guān)，在前期的工作中可發(fā)現(xiàn)剛出雛時公、母番鴨的體質(zhì)量較為接近，但是公鴨的生長速度要比母鴨快，在第2周齡開始差異就已經(jīng)達(dá)到了顯著性水平，在10周齡左右公鴨的體質(zhì)量一般是母鴨的1.5倍[12]。胸肌組織中IGF-I基因mRNA表達(dá)量要比腿肌組織中高，這是否與胸肌組織發(fā)育比褪肌組織發(fā)育遲、發(fā)育時間長有關(guān)，還需進(jìn)一步認(rèn)證。通過本試驗，闡述了番鴨IGF-I基因在肌肉生長發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步研究IGF-I基因的功能以及通過日糧營養(yǎng)調(diào)控其表達(dá)提供了資料。

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