金錢草總黃酮對草酸鈣結晶腎損傷的作用機制

解海杰，高宏偉，王 軍，李傳波，張昌文，劉春雨

全世界泌尿系結石的發(fā)病率已達10%～15%[1]。一水合草酸鈣（calcium oxalate monohydrate，COM）可刺激腎小管上皮細胞并引起腎損傷[2]，促進草酸鈣結晶粘附，進一步引起結晶積聚和結石形成[3]。復方金錢草顆粒具有抗腎結石、利尿、減輕輸尿管張力和抗炎作用,對尿路結石有良好的防治作用[4]。最近的研究顯示，金錢草黃酮提取物能抑制高草酸尿癥大鼠腎臟草酸鈣晶體的形成[5-6]。但金錢草總黃酮抑制草酸鈣結石的機制并不明確，本文探討金錢草總黃酮提取物對COM誘導腎小管上皮細胞凋亡所致腎損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥物 金錢草總黃酮購自于西安天瑞生物技術有限公司。第一抗體抗人腎損傷分子（kidney injury molecule-1，KIM-1）、抗LC3-II、抗p-p38、抗p38（1:1000）、內參β-actin均購自于Merck Millipore。

1.2 COM晶體準備 二水氯化鈣（10 mmol/L,CaCl2·2H2O）和草酸鈉（10 mmol/L, Na2C2O4）購自國藥，加入到緩沖液Tris-HCl（10 mmol/L,pH 7.4）中，使其終濃度分別為5 mmol/L和0.5 mmol/L。混合液于室溫下過夜，然后在3000 r/min轉速下離心5 min。棄上清，用甲醇清洗沉淀。3000 r/min離心5 min后去甲醇，沉淀干燥后于37℃過夜。在紫外線輻射下凈化30 min，即制備成COM晶體。

1.3 細胞培養(yǎng)與處理 腎小管上皮細胞（HK-2細胞）購自于中國科學院上海細胞庫，于含有10%胎牛血清（Gibco）、1.2%青霉素/鏈霉素、2mol/L的L-谷氨酸的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于含5%CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育。HK-2細胞接種于24孔板過夜。COM晶體處理細胞48 h使其終濃度分別為0.1、0.5、1、2和5 mmol/L。

1.4 儀器 Eppendorf 5418 小型高速離心機（德國），BINDER C150二氧化碳培養(yǎng)箱（德國），賽默飛Multiskan GO全波長讀數(shù)儀（美國），BD FACS 420流式細胞儀（美國），GE Typhoon FLA 9500 多功能激光成像儀（美國）。

1.5 分組 將腎小管上皮細胞分為6組：對照組、金錢草總黃酮處理組（TF組）、p38絲裂原活化激酶（p38/MAPK）抑制組（SB組）、COM處理組（COM組）、COM和金錢草總黃酮處理組（CTF組）、COM和p38/MAPK抑制組（CSB組）。TF組給予50 μg/mL金錢草總黃酮處理，SB組給予50 μmol/L的SB203580即p38/MAPK抑制劑處理，COM組給予2 mmol/L的COM處理，CTF組給予COM和50 μg/mL金錢草總黃酮處理，CSB組給予2 mmol/L的COM和50 μmol/L的SB203580處理。

1.6 觀察指標及檢測方法 （1）測定細胞存活率。WST-1法檢測HK-2細胞的生存能力，測定細胞存活率。不同處理組的HK-2細胞（對照組，0.1、0.5、1、2和5 mmol/L COM組）接種于含DMEM（10%胎牛血清）的96孔板中，隨后將WST-1加入培養(yǎng)孔中于37 ℃孵育2 h。分光光度計設定測量波長450 nm，參考波長630 nm，讀取各組吸光度值A。各組細胞活力以其吸光度值與空白對照組吸光度值的比值表示。（2）測定細胞凋亡率，用流式細胞術檢測細胞凋亡數(shù)。收集6組細胞，1500 r/min離心5 min，PBS液洗滌3次。加入1×Annexin V結合緩沖液使各組細胞終濃度為5×105/mL。加入Annexin-V和PI溶液（1 μg/mL，100 μg）于室溫染色15 min。用流式細胞術檢測細胞凋亡數(shù)。細胞凋亡率（%）=（凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%。（3）蛋白免疫印跡測定腎損傷標志物KIM-1，腎小管細胞損傷通路相關分子p38及自噬相關蛋白LC3-II的表達。RIPA緩沖液提取來自于不同組別的HK-2細胞中的總蛋白。蛋白溶液于12 000 r/min離心15 min，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白，轉膜。5%脫脂奶粉封閉2 h。ECL系統(tǒng)（GE）檢測蛋白質-抗體復合物。

1.7 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。各組間的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用bonferroni方法，以P ＜ 0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 COM誘導降低HK-2細胞存活率 應用COM處理HK-2細胞建立體外泌尿系結石細胞模型，與對照組相比，隨著COM濃度的增加，HK-2細胞的存活率逐漸下降（圖1）。

圖1 不同濃度COM處理HK-2細胞后的細胞存活率

圖2 2 mmol/L COM誘導HK-2細胞不同時長KIM-1、LC3-II、p-p38和p38蛋白含量的變化

2.2 COM誘導HK-2細胞不同時長KIM-1，LC3-II，p-p38和p38蛋白含量的變化 應用COM處理腎小管上皮細胞建立體外泌尿系結石細胞模型，在2 mmol/L COM處理的腎小管上皮細胞中，隨著時間的增加， KIM-1、p-p38、LC3-II表達增加（圖2）。

2.3 阻斷p38/MAPK通路對COM誘導的HK-2細胞凋亡的影響 COM可誘導HK-2細胞凋亡增加，CSB組細胞凋亡率較COM組細胞凋亡率降低，應用p38/MAPK抑制劑SB203580可抑制COM誘導的細胞凋亡（圖3、4）。

圖3 各組HK-2細胞凋亡率的變化

圖4 阻斷p38/MAPK通路對COM誘導的HK-2細胞凋亡的影響

2.4 阻斷p38/MAPK通路對COM誘導的HK-2細胞自噬的影響 COM可誘導HK-2細胞過度自噬，CSB組自噬相關蛋白LC3-II較COM組細胞降低（圖5、6）。

圖5 各組LC3-II/actin表達水平

圖6 阻斷p38/MAPK通路對COM誘導HK-2細胞LC3-II/actin表達水平的變化

2.5 金錢草總黃酮對COM誘導HK-2細胞p-P38蛋白表達的影響 Western blotting結果顯示，CTF組較COM組p-p38蛋白水平降低，說明金錢草總黃酮可阻斷p38/MAPK通路（圖7）。2.6 金錢草總黃酮對COM誘導的HK-2細胞存活率的影響 隨著金錢草總黃酮濃度的增加，HK-2細胞存活率也逐漸增加，說明金錢草總黃酮對HK-2細胞具有保護作用（圖8）。

圖7 金錢草總黃酮對COM誘導HK-2細胞p-P38蛋白表達的影響

圖8 不同濃度金錢草總黃酮對COM誘導的HK-2細胞存活率的影響

2.7 金錢草總黃酮對COM誘導的HK-2細胞凋亡的影響 CTF組細胞凋亡率較COM組細胞凋亡率降低，金錢草總黃酮可抑制COM誘導的細胞凋亡（圖3、9）。

圖9 金錢草總黃酮對COM誘導的HK-2細胞凋亡的影響

2.8 金錢草總黃酮對COM誘導的HK-2細胞自噬的影響 CTF組自噬相關蛋白LC3-II較COM組降低，金錢草總黃酮可抑制COM誘導的細胞過度自噬（圖5、10）。

圖10 金錢草總黃酮對COM誘導的HK-2細胞自噬LC3-II水平的變化

3 討論

泌尿系結石是全球性常見病，其發(fā)病率約10%～15%，并有逐年增高的趨勢[7]。雖然如體外沖擊波碎石術、經(jīng)皮腎鏡取石術、經(jīng)尿道輸尿管鏡取石術等微創(chuàng)技術已廣泛應用并取得成效，但泌尿系結石的復發(fā)率仍然很高[8]。泌尿系結石成分最常見的是草酸鈣結石，其中COM約占80%。目前結石成因最為重要的觀點是草酸鈣對腎小管上皮細胞損傷假說[9]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著COM濃度的升高，細胞存活率逐漸降低，并且KIM-1、p38及自噬相關蛋白LC3-II的表達也增加，抑制p38/MAPK通路可減少細胞過度自噬和凋亡。腎損傷標志物KIM-1是MAPK的下游基因，推測草酸鈣通過激活p38/MAPK通路引起腎小管上皮細胞出現(xiàn)過度自噬，細胞凋亡水平增加，導致腎小管上皮細胞的損傷。這與Paleerath等[10]研究結果相一致，其研究發(fā)現(xiàn)COM晶體會通過p38 MAPK活化導致腎小管上皮細胞緊密連接屏障功能的破壞。草酸鈣導致的腎損傷與p38/MAPK通路激活有關，從而導致草酸鈣晶體的沉積，而抑制p38/MAPK通路可減少腎小管上皮細胞凋亡[11]。

金錢草作為排石之要藥，其臨床作用已得到不斷地驗證，但其作用機制尚不明確。研究顯示金錢草可抑制草酸鈣結晶聚集并減輕腎損傷[12]。Rodgers等[13]報道，金錢草湯劑可顯著降低人工合成尿液中草酸鈣結晶的平均體積，并減少草酸鈣結晶的飽和率，從而證明金錢草可能是一種有效的草酸鈣抑制劑。Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)黃酮類是金錢草正丁醇部位的主要成分，總黃酮對OH-和O2-具有清除功能，且能減少乙二醇誘導的大鼠腎結石的形成。最近研究[15]在動物實驗發(fā)現(xiàn)金錢草總黃酮具有抗氧化應激作、抗炎作及堿化尿液的作用，降低單核細胞趨化蛋白-1、骨橋蛋白的水平，減輕腎損傷，抑制結石的形成。本研究發(fā)現(xiàn)在COM處理過的HK-2細胞中加入金錢草總黃酮后KIM-1、p38及自噬相關蛋白LC3-II的表達水平降低，同時細胞凋亡水平降低，推測金錢草總黃酮可阻斷p38/MAPK通路，抑制COM誘導的HK-2細胞凋亡和過度自噬，起到保護腎小管上皮細胞的作用。

綜上所述，草酸鈣可能通過激活p38/MAPK通路導致腎小管上皮損傷，使草酸鈣晶體發(fā)生黏附，從而形成結石。而金錢草總黃酮可通過阻斷p38/MAPK通路抑制腎小管上皮細胞的過度自噬和凋亡，減少腎小管上皮細胞的損傷，從而抑制泌尿系結石的形成。

[1] Chung SD, Liu SP, Lin HC.A population-based study on the association between urinary calculi and kidney cancer [J].Can Urol Assoc J, 2013, 7(11-12): E716-721.

[2] Gan QZ, Sun XY, Bhadja P, et al.Reinjury risk of nano-calcium oxalate monohydrate and calcium oxalate dihydrate crystals on injured renal epithelial cells: aggravation of crystal adhesion and aggregation [J].Int J Nanomed, 2016, 11: 2839-2854.

[3] Mittal A, Tandon S, Singla SK, et al.In vitro inhibition of calcium oxalate crystallization and crystal adherence to renal tubular epithelial cells by Terminalia arjuna [J].Urolithiasis, 2016, 44(3):287-287.

[4] 周軍, 韋桂寧, 吳超偉, 等.復方金錢草顆粒對腎結石的影響及其利尿、解痙、抗炎作用 [J].中國實驗方劑學雜志, 2011,17(18): 206-209.

[5] 鄒志輝, 崔維奇, 諶輝鵬, 等.金錢草黃酮提取物對大鼠腎臟草酸鈣結石形成的影響 [J].中國實驗方劑學雜志, 2013,19(4): 195-199.

[6] 陶婷婷, 呂伯東, 黃曉軍, 等.金錢草總黃酮提取液抑制大鼠草酸鈣結石形成機制的研究 [J].中國現(xiàn)代醫(yī)生, 2016, 54(18):30-33.

[7] Edvardsson VO, Indridason OS, Haraldsson G, et al.Temporal trends in the incidence of kidney stone disease [J].Kidney Int,2013, 83(1): 146-152.

[8] Ferraro PM, Curhan GC, D' Addessi A, et al.Risk of recurrence of idiopathic calcium kidney stones: analysis of data from the literature [J].J Nephrol, 2016, 30(2): 227-233.

[9] Ouyang JM, Yao XQ, Tan J, et al.Renal epithelial cell injury and its promoting role in formation of calcium oxalate monohydrate[J].J Biol Inorg Chem, 2011, 16(3): 405-416.

[10] Peerapen P, Thongboonkerd V.p38 MAPK mediates calcium oxalate crystal-induced tight junction disruption in distal renal tubular epithelial cells [J].Sci Rep, 2013, 3:1041.

[11] Li X, Ma J, Shi W, et al.Calcium Oxalate Induces Renal Injury through Calcium-Sensing Receptor [J].Oxid Med Cell Longev,2016, 2016: 5203801.

[12] Mi J, Duan J, Zhang J, et al.Evaluation of antiurolithic effect and the possible mechanisms of Desmodium styracifolium and Pyrrosiae petiolosa in rats [J].Urol Res, 2012, 40(2): 151-161.

[13] Rodgers AL, Webber D, Ramsout R, et al.Herbal preparations affect the kinetic factors of calcium oxalate crystallization in synthetic urine: implications for kidney stone therapy [J].Urolithiasis, 2014, 42(3): 221-225.

[14] Zhou C, Luo JG, Kong LY.Quality evaluation of Desmodium styracifolium using high-performance liquid chromatography with photodiode array detection and electrospray ionisation tandem mass spectrometry [J].Phytochem Anal, 2012, 23(3): 240-247.

[15] Zhou J, Jin J, Li X, et al.Total flavonoids of Desmodium styracifolium attenuates the formation of hydroxy-L-prolineinduced calcium oxalate urolithiasis in rats [J].Urolithiasis, 2017.doi: 10.1007/s00240-017-0985-y.