木醋桿菌合成細菌纖維素增效因子的篩選

常冬妹，盧紅梅 *，陳 莉，張麗平，楊鳳儀，賈青慧

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是由D-葡萄糖單體以β-1,4糖苷鍵連接而成的直鏈多糖，直鏈之間彼此呈平行狀，不呈螺旋結(jié)構(gòu)，沒有分支結(jié)構(gòu)[1]。細菌纖維素具有純度高、結(jié)晶度高、聚合度高、可降解、超細性（納米級）及生物適應(yīng)性等優(yōu)良性能[2]。在眾多產(chǎn)生纖維素的細菌中，木醋桿菌是最早發(fā)現(xiàn)也是研究較為透徹的纖維素產(chǎn)生菌，是已知合成纖維素能力最強的微生物菌種。近年來隨著科技的進步以及人們對細菌纖維素本質(zhì)以及合成機理的更深入了解[3]，細菌纖維素作為一種新型的生物材料已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于食品、造紙、醫(yī)學(xué)材料、聲音振動膜等多個領(lǐng)域[4]。但由于其產(chǎn)量較低且生產(chǎn)成本高，極大地制約了細菌纖維素工業(yè)化推廣應(yīng)用[5]。

目前，國內(nèi)外對細菌纖維素研究的重點集中在細菌纖維素產(chǎn)量的提高和改性研究方面，而提高細菌纖維素產(chǎn)量的途徑主要包括選育高產(chǎn)菌株、優(yōu)化工藝條件、改進發(fā)酵方式與探討代謝機理等[6]。本研究選擇相對較多的玉米漿、Tween-80、羧甲基纖維素（carboxy methylated cellulose，CMC）、海藻酸鈉、咖啡因、煙酸、生物素以及工業(yè)化生產(chǎn)原料的典型代表椰子水作為增效劑，研究8種增效劑對木醋桿菌產(chǎn)細菌纖維素的增效作用，在合成細菌纖維素過程中單一添加八種物質(zhì)，并篩選出對實驗室保藏的木醋桿菌（Acetobacter xylinus）合成細菌纖維素有增效作用的物質(zhì)，以產(chǎn)量為指標測定每一種增效物質(zhì)的最適添加量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種及材料

木醋桿菌（Acetobacter xylinum）：貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室保藏；椰子汁：市售椰子破殼取汁液，于冰箱（4 ℃）中保藏；玉米漿：市售。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉（分析純）：重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；煙酸（分析純）：重慶川江化學(xué)試劑廠；無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；海藻酸鈉（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；咖啡因（分析純）：阿拉丁試劑；羧甲基纖維素（分析純）、Tween-80（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；生物素（分析純）：河南天興食品添加劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，檸檬酸1.0 g/L，磷酸氫二鈉2.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

木醋桿菌液體種子培養(yǎng)基[7]：蔗糖20.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，無水乙醇3.0%，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8，121 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖50.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，蛋白胨8.0 g/L，磷酸二氫鉀4.3 g/L，硫酸鎂2.5 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

添加物培養(yǎng)基：根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方稱取所需量的8種增效物質(zhì)，用蒸餾水配制。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50.0 g/L，蛋白胨15.0 g/L，檸檬酸2.0 g/L，Na2HPO·412H2O 2.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，無水乙醇10.0 mL，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250型生化培養(yǎng)箱：上海悅豐儀器儀表有限公司；HH-b型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；101-1型電熱鼓風干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；FA2004N型精密電子天平：上海菁海儀器有限公司；YXQ-LS-50SI型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

菌種的活化：挑取適量原代木醋桿菌轉(zhuǎn)接至木醋桿菌斜面培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下靜置培養(yǎng)72 h。

種子液培養(yǎng)：準確量取50 mL液體種子培養(yǎng)基于250 mL的三角瓶中，121 ℃滅菌20 min，冷卻后先無菌地在液體種子培養(yǎng)基中加入無水乙醇3%，再接入活化的木醋桿菌三環(huán)，置于28 ℃、100 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。

靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：準確量取50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基于250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min，冷卻后接入木醋桿菌種子液8%，置于30 ℃條件下靜置培養(yǎng)192 h。

增效因子的篩選：分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中單一加入一定比例的8種物質(zhì)，添加量如表3所示，以接種量8%置于30 ℃條件下靜置培養(yǎng)8 d，對細菌纖維膜進行處理和產(chǎn)量的測定。

表1 增效因子添加量優(yōu)化因素與水平Table 1 Factors and levels of synergistic factor addition

1.3.2 細菌纖維素的處理

收集細菌纖維素膜，用蒸餾水反復(fù)沖洗除去膜表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)后，置于80 ℃，0.1 mol/L的NaOH溶液中，維持2 h以除去菌體蛋白和殘余的培養(yǎng)基，至膜呈乳白色半透明狀，冷卻后用0.1 mol/L HCI中和30 min，自來水充分洗滌，直至呈中性，80 ℃干燥至質(zhì)量恒定[8]。

1.3.3 細菌纖維素產(chǎn)量測定

將處理過的細菌纖維素膜烘干后稱其干質(zhì)量，BC產(chǎn)量的計算公式如下[9]：

2 結(jié)果與分析

2.1 椰子汁添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

圖1 椰子汁添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of coconut juice addition on bacterial cellulose production

分別在50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0、10 mL、20 mL、25 mL、30 mL、40 mL和50 mL的椰子汁，30 ℃條件下靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)8 d，對細菌纖維素進行產(chǎn)量測定。不同椰子汁添加量對細菌纖維素產(chǎn)量影響結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著椰子汁添加量的增大，細菌纖維素的產(chǎn)量也不斷增加。在椰子汁添加量為0～50%時，木醋桿菌產(chǎn)細菌纖維素的量隨椰子汁添加量的增長迅速增長；椰子汁添加量＞50%之后增長緩慢；當椰子汁添加為80%時，細菌纖維素的產(chǎn)量最高為6.282 g/L，是空白實驗組細菌纖維素產(chǎn)量（1.498 g/L）的4.19倍，說明椰子汁對細菌纖維素的產(chǎn)量有明顯的增效作用[10]。因此綜合考慮確定椰子水的最適添加量為60%，此時細菌纖維素產(chǎn)量為6.008 g/L。

2.2 玉米漿添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

分別在50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入發(fā)酵液總體積0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL和10 mL的玉米漿，30 ℃條件下靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)8 d，對細菌纖維素進行產(chǎn)量測定。不同玉米漿添加量對的細菌纖維素產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 玉米漿添加量的細菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of corn steep liquor addition on bacterial cellulose production

由圖2可知，隨著玉米漿添加量的增加，細菌纖維素的產(chǎn)量總體趨勢呈現(xiàn)先增長后降低的趨勢，當玉米漿添加量為10%時，細菌纖維素的產(chǎn)量最高，為8.534 g/L，是空白組的5.67倍。這可能是由于一定量玉米漿中豐富的營養(yǎng)成分利于木醋桿菌的生長繁殖[11]，且玉米漿可以提高發(fā)酵培養(yǎng)基的緩沖能力，減緩發(fā)酵液pH值降低的速度，使其維持在一個有利于木醋桿菌合成細菌纖維素的環(huán)境，但是過量的玉米漿會使發(fā)酵液內(nèi)某些不利于菌體生長繁殖的物質(zhì)累積，從而抑制了木醋桿菌合成細菌纖維素的進行[12]，因此確定玉米漿的最適添加量為10%。

2.3 咖啡因添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

在50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入0、0.05 mg、0.10 mg、0.15 mg、0.20 mg、0.25 mg和0.30 mg的咖啡因，30 ℃條件下靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)8 d，對細菌纖維素進行產(chǎn)量測定，不同咖啡因添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，當不添加咖啡因時，細菌纖維素產(chǎn)量最高為1.498 g/L。隨著咖啡因添加量的增加，細菌纖維素的產(chǎn)量出現(xiàn)小范圍的波動，分析可能由于咖啡因在一定范圍內(nèi)抑制磷酸二酯酶的活性，使環(huán)狀鳥苷酸增加，而環(huán)狀鳥苷酸是纖維素合成酶的激活劑，從而使纖維素產(chǎn)量增加[13]，但產(chǎn)量均低于不添加咖啡因時所合成的細菌纖維素，這說明咖啡因?qū)τ谀敬讞U菌合成細菌纖維素有抑制作用。

圖3 咖啡因添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of caffeine addition on bacterial cellulose production

2.4 Tween-80對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

分別在50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0、0.01 g、0.02 g、0.03 g、0.04 g、0.05 g和0.06 g Tween-80，30 ℃條件下靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)8 d后對細菌纖維素進行產(chǎn)量測定，不同添加量Tween-80對細菌纖維素產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 Tween-80添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of Tween-80 addition on bacterial cellulose production

由圖4可知，隨著Tween-80添加量的增加，細菌纖維素產(chǎn)量有先增加后下降的趨勢。當Tween-80添加量為0.8 g/L時細菌纖維素產(chǎn)量達到最高2.256 g/L，是產(chǎn)量為1.508 g/L的空白實驗的1.5倍。這可能是因為Tween-80作為一種表面活性劑可以影響細胞膜的透性，有利于細菌纖維素的合成，但當添加量過大時會對細胞膜造成損傷影響菌體的正常生長代謝，從而不利于細菌纖維素的合成[14]，所以Tween-80對細菌纖維素產(chǎn)量有明顯增效作用且確定Tween-80的最適添加量為0.8 g/L。

2.5 羥甲基纖維素（CMC）對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

分別在50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0、0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g和0.6 g的CMC，30 ℃條件下靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)8 d，之后對細菌纖維素膜進行產(chǎn)量測定，不同CMC添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 CMC添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of CMC addition on bacterial cellulose production

由圖5可知，細菌纖維素的產(chǎn)量隨著CMC添加量的增大呈現(xiàn)先增加后略降低的趨勢，當CMC添加量為4 g/L時，細菌纖維素的產(chǎn)量最高為2.044 g/L，是空白實驗組產(chǎn)量（1.504 g/L）的1.36倍。這可能是因為CMC在發(fā)酵過程中可部分被降解作為碳源物質(zhì)被木醋桿菌利用，同時CMC可以改變BC聚合方式，并增加培養(yǎng)基的黏度，利于菌體的生長代謝，可以更充分的利用營養(yǎng)物質(zhì)。但當CMC的添加量過大時，培養(yǎng)基的黏度過大，不利于菌體的生長繁殖和代謝過程，細菌纖維素的產(chǎn)量反而較低，所以選擇CMC的最適添加量為4 g/L。這與朱青梅等[15]用CMC發(fā)酵生產(chǎn)改性纖維素的研究結(jié)果當CMC的添加量為6 g/L時，細菌纖維素的產(chǎn)量高達10.41 g/L存在很大差距，可能是因為朱青梅等選用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為椰子水培養(yǎng)基，基礎(chǔ)產(chǎn)量就很高。

2.6 海藻酸鈉對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

在50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入0、0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g的海藻酸鈉，30 ℃條件下靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)8 d，之后對細菌纖維膜進行產(chǎn)量測定。不同添加量海藻酸鈉對細菌纖維素產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖6所示。

圖6 海藻酸鈉添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of sodium alginate addition on bacterial cellulose production

由圖6可知，在海藻酸鈉添加量為2 g/L時，細菌纖維素產(chǎn)量達到最高1.548 g/L，此時空白組細菌纖維素產(chǎn)量為1.514 g/L，增效作用并不明顯。之后隨著海藻酸鈉添加量的增多，海藻酸鈉對木醋桿菌合成細菌纖維素不但沒有促進作用，反而使細菌纖維素的產(chǎn)量快速降低。原因可能是因為Na+的作用。

2.7 煙酸對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

分別在50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0、0.025 mg、0.05 mg、0.075 mg、0.1 mg、0.125 mg、0.150 mg的煙酸，30 ℃條件下靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)8 d，之后對細菌纖維膜進行產(chǎn)量測定。不同添加量煙酸對細菌纖維素產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖7所示。

圖7 煙酸添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of niacin addition on bacterial cellulose production

由圖7可知，隨著煙酸的添加量不斷增加，細菌纖維素的產(chǎn)量呈現(xiàn)先急劇增加后緩慢降低的趨勢，當煙酸的添加量低于1.0 mg/L的時候細菌纖維素的產(chǎn)量隨著煙酸添加量的增大而增大，當添加量高于1.0 mg/L的時候細菌纖維素的產(chǎn)量反而有緩慢的開始降低，在1.0 mg/L時細菌纖維素的產(chǎn)量最高為2.842 g/L，是空白實驗組的產(chǎn)量1.512 g/L的1.88倍。這可能是由于煙酸作為維生素B族的一種為輔酶Ⅰ（NAD）和輔酶Ⅱ（NADP）的直接前體，在微生物代謝中起重要作用，有利于木醋桿菌細胞的生長和代謝產(chǎn)物的合成[16]，因此選擇煙酸的最適添加量為1.0 mg/L。

2.8 生物素對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

在50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入0、0.75 mg、1.00 mg、1.25 mg、1.50 mg、1.75 mg和2.00 mg的生物素，30 ℃條件下靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)8 d，之后對細菌纖維膜進行產(chǎn)量測定。不同添加量生物素對細菌纖維素產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知，隨著生物素添加量的不斷增加，細菌纖維素的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當生物素添加量為25 mg/L的時候細菌纖維素產(chǎn)量最高為3.118 g/L，是空白試驗組的細菌纖維素產(chǎn)量（1.515 g/L）的2.06倍，增效作用明顯。這可能是由于生物素也稱維生素H，是丙酮酸羧化酶的輔酶，該酶與三羧酸循環(huán)（tricarboxylicacidcycle，TCA）和糖異生作用相關(guān)，適量的生物素可以加快草酰乙酸產(chǎn)生的速度，從而可以促進木醋桿菌合成細菌纖維素。因此選擇生物素的最適添加量為25 mg/L。

圖8 生物素添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of biotin addition on bacterial cellulose production

3 結(jié)論

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)木醋桿菌合成細菌纖維素時，細菌纖維素的產(chǎn)量比較低，在所選取的椰子水、玉米漿、咖啡因、Tween-80、CMC、海藻酸鈉、煙酸、生物素分別添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)木醋桿菌合成細菌纖維素，結(jié)果證實，椰子水、玉米漿、Tween-80、CMC、煙酸和生物素這六種物質(zhì)對于木醋桿菌合成細菌纖維素有促進作用，作用大小為玉米漿＞椰子水＞生物素＞煙酸＞Tween-80＞CMC，因此，玉米漿可以作為工業(yè)化生產(chǎn)細菌纖維素的原料，海藻酸鈉的增效效果并不明顯，而咖啡因有一定的抑制作用。

結(jié)果表明，椰子水、玉米漿、Tween-80、CMC、煙酸和生物素這六種具有增效作用的物質(zhì)的最適添加量分別為椰子汁60%、玉米漿10%、Tween-80 0.8 g/L、CMC 4 g/L、煙酸1.0 mg/L、生物素25 mg/L，在此添加量下的細菌纖維素產(chǎn)量分別為6.008 g/L、8.534 g/L、2.256 g/L、2.044 g/L、2.842 g/L、3.118 g/L。在已確定的最適添加量基礎(chǔ)上，可進一步對相同增效機理和不同增效機理的物質(zhì)進行復(fù)配，以細菌纖維素的產(chǎn)量為衡量指標，確定復(fù)配的最佳組合，探究更好的增效方案。

[1]RADIMAN C,YULIANI G.Coconut water as a potential resource for cellulose acetate membrane preparation[J].Polym Int,2008,57(3):502-508.

[2]BACKDAHL H,HELENIUS G,BODIN A,et al.Mechanical properties of bacterial cellulose and interactions with smooth muscle cells[J].Biomatirials,2006,27(9):2141-2149.

[3]黃 莉，王英男，夏秀芳，等.細菌纖維素的基本特性與其應(yīng)用[J].包裝與食品機械，2013，16（5）：60-63.

[4]賈士儒，劉 淼，薄 濤.細菌纖維素的研究及其應(yīng)用[J].齊魯工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，27（3）：9-14.

[5]楊 穎，賈靜靜，陸勝民.細菌纖維素高產(chǎn)菌株的鑒定及產(chǎn)物分析[J].中國食品學(xué)報，2012，12（7）：216-221.

[6]張麗平，盧紅梅，彭湘屏，等.淋澆發(fā)酵法生產(chǎn)細菌纖維素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)研究[J].食品工業(yè)科技，2012，22（33）：197-201.

[7]CHENG K C,CATCHMARK J M,DEMIRCI A.Effect of different additives on bacterial cellulose production byAcetobacter xylinumand analysis of material property[J].Cellulose,2009,16(6):1033-1045.

[8]崔思穎，朱明軍，鄧毛程，等.不同培養(yǎng)方式制備的細菌纖維素性質(zhì)的比較[J].造紙科學(xué)與技術(shù)，2010，29（1）：67-70.

[9]彭湘屏，盧紅梅.不同途徑提高細菌纖維素產(chǎn)量的比較[J].中國釀造，2010，29（10）：148-150.

[10]王志國，鐘春燕，王錫彬，等.椰子水自然發(fā)酵條件對細菌纖維素生產(chǎn)的影響[J].中國釀造，2009，28（4）：32-34.

[11]李 斌，鐘春燕，王錫彬.椰子水與菠蘿汁生產(chǎn)細菌纖維素的對比研究[J].中國釀造，2014，33（6）：27-30.

[12]李 飛，陳 琳，唐曉燕，等.以玉米漿和木薯為原料機械攪拌發(fā)酵制備細菌纖維素的研究[J].工業(yè)微生物，2014，44（2）：7-13.

[13]張鳳清，張海悅，彭 悅，等.玉米漿做Acetobacter xylinum培養(yǎng)基生產(chǎn)纖維素的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].工業(yè)技術(shù)，2005，26（2）：107-111.

[14]鄧毛程，吳亞麗.表面活性劑對木醋桿菌產(chǎn)細菌纖維素的影響[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（7）：32-34.

[15]朱清梅，馮玉紅，林 強，等.利用椰子水生物合成CMC 改性細菌纖維素[J].精細化工，2010，27（7）：654-658.

[16]周伶俐，孫東平，吳清杭，等.Acetobacter xylinumNUST4 合成細菌纖維素發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報，2005，32（6）：96-99.