抗菌肽magaininⅡ的密碼子優(yōu)化及在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達

陳玉海，陳慶煌，陳科，章亭洲，陳吉龍,

1 中國科學院微生物研究所 中國科學院病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101

2 福建農(nóng)林大學動物科學學院 動物醫(yī)學系，福建 福州 350002

3 浙江工商大學環(huán)境科學與工程學院，浙江 杭州 310035

抗菌肽是生命體抵御外界病原微生物入侵的過程中產(chǎn)生的一種小分子多肽，對細菌、真菌、原蟲、病毒甚至癌細胞等都具有殺傷作用[1-11]?？咕姆N類繁多，廣泛存在于動物、植物以及細菌體內(nèi)，是機體抵抗外界病原微生物入侵的天然防御系統(tǒng)的重要組成部分，是機體天然免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)分子[12-17]?？咕牟煌趥鹘y(tǒng)抗生素，它具有獨特的殺菌機制，不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，且不會對機體正常細胞造成損害[18]。因此，抗菌肽是一種具有廣闊開發(fā)前景的抗菌制劑，在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)、畜牧業(yè)等行業(yè)中有廣泛的應(yīng)用和市場前景。目前，從各種生物中篩選、鑒定以及人工改造與合成抗菌肽已成為抗菌物質(zhì)發(fā)展的熱點領(lǐng)域之一[19-24]。然而，抗菌肽的表達與純化困難制約了它們的應(yīng)用。

1987年Zasloff從非洲爪蟾皮膚中分離出了兩種具有廣譜抗菌活性的抗菌肽，即magaininⅠ和 magaininⅡ[25]；隨后 Giovannini等證實抗菌肽 magainin大量儲存于非洲爪蟾皮膚的顆粒腺中[26]。其中抗菌肽magaininⅡ有23個氨基酸組成，分子量為 2.47 kDa，具有兩親性和螺旋結(jié)構(gòu)，在低濃度下即能夠?qū)Ω锾m氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、原蟲、腫瘤等都具有殺傷作用[4,8,25,27]。有趣的是，同是來源于非洲爪蟾的另一種抗菌肽PGLa與magaininⅡ在殺菌、抗腫瘤方面具有很好的協(xié)同效應(yīng)[28-33]?；诳咕膍againinⅡ、PGLa的上述功能，本文主要探討抗菌肽 magaininⅡ和雜合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa在細菌和畢赤酵母中的表達以及純化策略，為后續(xù)生產(chǎn)應(yīng)用提供一定前期指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和菌種

畢赤酵母表達載體pPIC9k，表達菌株KM71為中國科學院微生物研究所邱并生研究員惠贈；原核表達載體 pGEX-5x-3，表達菌株大腸桿菌Rostta(DE3)為本室保存。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB(北京) 有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，凝膠純化回收試劑盒，酵母基因組提取試劑盒購自天根生化科技 (北京) 有限公司；Flag、his等抗體購自Sigma-Aldrich等公司；Glutathione Sepharose 4B購自GE Healthcare公司。

1.1.3 密碼子優(yōu)化前后的基因與對應(yīng)氨基酸序列

抗菌肽 magaininⅡ以及雜合抗菌肽magaininⅡ-PGLa分別按照大腸桿菌和畢赤酵母偏好性密碼子進行優(yōu)化。

magaininⅡ按照大腸桿菌偏好性密碼子進行優(yōu)化，優(yōu)化前后序列如下：

magaininⅡ-PGLa按照畢赤酵母偏好性密碼子進行優(yōu)化，優(yōu)化前后序列如下：

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽 magaininⅡ以及雜合抗菌肽magaininⅡ-PGLa的基因序列優(yōu)化與合成

利用Jcat (http://www.jcat.de/) 等軟件，按照大腸桿菌E. coli密碼子偏好性優(yōu)化magaininⅡ的基因序列，同時，按照畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化magaininⅡ-PGLa雜合抗菌肽的基因序列，并在北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成優(yōu)化后的序列。

合成的magaininⅡ序列氨基端含有his/flag標簽，表達后可以用腸激酶切割得到天然的不帶任何其他氨基酸殘基的 magaininⅡ抗菌肽，為進一步研究表達的抗菌肽 magaininⅡ的活性提供保證。為便于后續(xù)檢測，合成的雜合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa氨基端也含有 his/flag標簽。

1.2.2 抗菌肽magaininⅡ的原核表達及純化

利用限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ和 XhoⅠ將合成的抗菌肽 magaininⅡ基因構(gòu)建到原核表達載體pGEX-5x-3中。測序無誤后，利用大腸桿菌Rostta(DE3)菌 株 在 22 ℃ 、IPTG 濃 度 為0.1 mmol/L的條件下誘導(dǎo)抗菌肽 magaininⅡ表達，超聲裂解后的上清部分含有融合蛋白GST-magaininⅡ，上清利用Glutathione Sepharose 4B 進行親和層析，并用前切割蛋白酶(PreScission Protease) 進行柱上切割 (On-column cleavage)，之后用 PBS (Phosphate buffered solution) 緩沖液洗脫，得到純化的抗菌肽，即不含GST標簽的可溶性抗菌肽magaininⅡ。

1.2.3 含天門冬氨酸-脯氨酸二聯(lián)氨基酸抗菌肽(DP-magaininⅡ)的原核表達與純化

據(jù)文獻報道，稀酸可以切割天門冬氨酸和脯氨酸之間的肽鍵，可以用于重組蛋白特別是包涵體蛋白的純化[10,34-35]。以合成的密碼子優(yōu)化過的抗菌肽基因為模板，構(gòu)建氨基端含有天門冬氨酸-脯氨酸的magaininⅡ抗菌肽DP-magaininⅡ，采用大腸桿菌Rostta (DE3)菌株在37 ℃、IPTG濃度為 0.6–1.0 mmol/L的條件下誘導(dǎo)抗菌肽DP-magaininⅡ的表達，并利用不同濃度的鹽酸對表達的GST融合抗菌肽進行切割。

1.2.4 雜合抗菌肽magaininⅡ-PGLa畢赤酵母表達載體的構(gòu)建

將合成的magaininⅡ-PGLa雜合抗菌肽，克隆到畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9k中，獲得pPIC9k-magaininⅡ-PGLa以及 pPIC9k-his/flagmagaininⅡ-PGLa。

1.2.5 畢赤酵母KM71的電轉(zhuǎn)化與雜合抗菌肽magaininⅡ-PGLa在畢赤酵母KM71中的整合情況檢測

利用限制性內(nèi)切酶SalⅠ將畢赤酵母表達載體 pPIC9k、pPIC9k-magaininⅡ-PGLa、pPIC9khis/flag-magaininⅡ-PGLa (各 5 μg) 分別線性化，利用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)化畢赤酵母 KM71感受態(tài)細胞 (參數(shù)：1.5 kV，200 ?，25 μF)，涂布 MD(Minimal Dextrose) 平板，待菌落長出，挑單克隆傳3代后用含0–4.0 g/L G418 的YPD (Yeast extract peptone dextrose) 平板進行篩選。同時提取所篩選酵母的基因組DNA，并利用Invitrogen公司說明書中提供的5'AOX1和3'AOX1引物序列，合成引物，檢測雜合抗菌肽在畢赤酵母基因組中的整合情況。

1.2.6 雜合抗菌肽magaininⅡ-PGLa在畢赤酵母中的表達及檢測

挑純化后的穩(wěn)定整合雜合抗菌肽基因的酵母菌單克隆于 BMGY (Buffered glycerolcomplex medium) 培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期，然后轉(zhuǎn)接至 BMMY (Buffered methanol-complex medium) 培養(yǎng)基，每24 h加入0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達。在不同時間點取上清，采用雙抗夾心ELISA方法檢測雜合抗菌肽的表達情況，具體方法如下：1) 用碳酸鹽緩沖液在ELISA板中包被一抗 (flag抗體)，4 ℃過夜；2)第2天，用含0.05% Tween 20的PBS洗液充分沖洗后加入 200 μL 封閉液 (PBS+1% BSA)，37 ℃封閉1 h；3) 用洗液充分沖洗后加入畢赤酵母表達的抗菌肽 100 μL (含有 his和 flag 標簽)，37 ℃孵育 1 h；4) 用洗液充分沖洗后加入酶標二抗(His-HRP抗體)，37 ℃孵育1 h；5) 用洗液充分洗脫后加入TMB底物溶液100 μL，37 ℃避光反應(yīng)15 min；6) 加入2 mol/L硫酸溶液50 μL終止反應(yīng)，3–5 min后用酶標儀檢測，波長和參考波長分別是450 nm和630 nm。

1.2.7 抗菌肽活性檢測方法

抗菌肽活性檢測方法如下：將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌DH5α接種于LB培養(yǎng)基中，加入抗菌肽濃縮液 (10倍濃縮，以空載體表達產(chǎn)物作對照)，37 ℃振蕩培養(yǎng)，在不同時間點取菌液測定菌體濃度，比較實驗組和對照組的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽magaininⅡ的原核表達

將構(gòu)建好的原核表達載體pGEX-magaininⅡ轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)菌株，在22 ℃、IPTG濃度為0.1 mmol/L的條件下，誘導(dǎo)抗菌肽 magaininⅡ表達。分別在0、2、4、6、8、10 h取樣檢測融合蛋白表達情況，如圖1所示，結(jié)果顯示 GST融合抗菌肽得到了高效表達，約在8 h表達量達到最高，經(jīng)超聲后SDS-PAGE檢測分析，蛋白主要以可溶性形式存在，利用前切割蛋白酶切割后獲得特異的目標條帶 (含有 his和 flag標簽，其中flag標簽內(nèi)部含有腸激酶的切割位點)。

如圖1所示，圖1A是在不同的誘導(dǎo)時間下表達的 GST-magaininⅡ融合蛋白的 SDS-PAGE結(jié)果，圖1B是利用Glutathione Sepharose 4B親和層析后的融合蛋白SDS-PAGE結(jié)果，圖1C是利用前切割蛋白酶切割后的 Tricine-SDS-PAGE結(jié)果，圖1D是GST融合蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。

2.2 抗菌肽 DP-magaininⅡ的原核表達與酸切割

在37 ℃，用IPTG誘導(dǎo)抗菌肽DP-magaininⅡ在大腸桿菌中的表達，初步純化后用不同濃度的鹽酸切割，純化和切割結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果表明，抗菌肽DP-magaininⅡ在大腸桿菌中沒有形成包涵體，重組蛋白以可溶形式存在，超聲后上清利用0.000 1–1.0 mmol/L HCl在85 ℃條件下切割8 h，發(fā)現(xiàn)在1.0 mmol/L (pH約為 2.5) 鹽酸進行切割時出現(xiàn)彌散條帶(Smeared bands)，這與文獻報道的最佳pH相符[10]，表明這一技術(shù)可以獲得magaininⅡ多肽。

圖1 抗菌肽magaininⅡ的原核表達與純化Fig. 1 Expression and purification of recombinant magaininⅡfusion protein. (A) The expression of recombinant magaininⅡ fusion protein under different time gradient. M: prestained protein ladder (Fermentas, SM0671). (B)Purified recombinant magaininⅡ fusion protein. M: prestained protein ladder (Fermentas, SM0671); 1: recombinant magaininⅡ fusion protein after purification; 2: recombinant magaininⅡ fusion protein before purification. (C)Digestion of recombinant magaininⅡ fusion protein with PreScission Protease. M: prestained protein ladder(Fermentas, SM1861); 1: recombinant magaininⅡ fusion protein after purification; 2: recombinant magaininⅡprotein after digestion; 3: control. (D) The structure of the GST-magainin fusion protein. GST: glutathione S-transferase; PPS: preScission protease cleavage site; His: his tag; Flag: flag tag; EkS: enterokinase cleavage site.

圖2 抗菌肽DP-magaininⅡ的原核表達與純化Fig. 2 Expression and acid digestion of DP-magaininⅡ fusion protein. (A) The purification of recombinant DP-magaininⅡ fusion protein. M: prestained protein ladder (Fermentas, SM0671); 1: recombinant DP-magaininⅡfusion protein after purification; 2: recombinant DP-magaininⅡ fusion protein before purification. (B) Digestion of recombinant DP-magaininⅡ fusion protein with hydrochloric acid. M: prestained protein ladder (Fermentas,SM1861); 1–5: different concentrations of hydrochloric acid; 1: 0.000 1 mmol/L; 2: 0.001 mmol/L; 3: 0.01 mmol/L; 4:0.1 mmol/L; 5: 1 mmol/L.

2.3 雜合抗菌肽magaininⅡ-PGLa在畢赤酵母中的表達及檢測

2.3.1 雜合抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)

雜合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa一級結(jié)構(gòu)見圖3，其中5'端為抗菌肽magaininⅡ，3'端為抗菌肽PGLa，中間用氨基酸序列為Gly-Gly-Cys-Cys-Gly-Gly含有二硫鍵的linker將兩種抗菌肽連接起來。

圖3 雜合抗菌肽magaininⅡ-PGLa的一級結(jié)構(gòu)Fig. 3 Primary structure of the magaininⅡ-PGLa hybrid antibacterial peptide.

2.3.2 穩(wěn)定表達雜合抗菌肽的畢赤酵母高產(chǎn)菌株的篩選

利用SalⅠ線性化pPIC9k-magaininⅡ-PGLa，pPIC9k-his/flag-magaininⅡ-PGLa以及空載體對照pPIC9k，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71并傳代，利用0–4.0 g/L的G418進行篩選，得到穩(wěn)定整合雜合抗菌肽的酵母菌單克隆。由于轉(zhuǎn)化 KM71得到的畢赤酵母表型都是甲醇利用緩慢型(Muts)，所以無需進行表型篩選，轉(zhuǎn)化后畢赤酵母高產(chǎn)菌株的篩選流程見圖4。

2.3.3 雜合抗菌肽在畢赤酵母中的整合情況檢測

提取畢赤酵母基因組 DNA，利用 5'AOX1和3'AOX1引物擴增，電泳結(jié)果如圖5所示，其中整合pPIC9K-magaininⅡ-PGLa的擴增片段為642 bp，整合pPIC9K-his/flag-magaininⅡ-PGLa的擴增片段為684 bp，對照擴增片段為492 bp。結(jié)果顯示雜合抗菌肽已經(jīng)穩(wěn)定整合入了畢赤酵母基因組中。

圖 4 表達雜合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa的畢赤酵母高產(chǎn)菌株的篩選Fig. 4 Screening of high-yielding strains of hybrid antibacterial peptide.

圖5 雜合抗菌肽在畢赤酵母中的整合情況檢測Fig. 5 PCR analysis of Pichia pastoris integrants. M:DNA marker; lane 1–3 show the 642 bp products from KM71/pPIC9K-magainin II-PGLa; lane 4 shows the 492 bp product from KM71/pPIC9K; lane 5-6 show the 684 bp products from KM71/pPIC9K-magaininⅡ-PGLa-his/flag.

2.3.4 雜合抗菌肽magaininⅡ-PGLa在畢赤酵母中的表達

分別在 0.5%甲醇誘導(dǎo) 0、48、72、96 h時取樣，采用ELISA檢測3株穩(wěn)定整合雜合抗菌肽 his/flag-magainin II-PGLa的酵母菌表達情況，結(jié)果如圖6A，結(jié)果顯示，菌株1的表達水平明顯高于其他菌株，且在72 h左右表達量達到最高?；钚苑治霰砻麟s合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa對大腸桿菌 DH5α生長有一定抑制作用(圖 6B)。

圖 6 雜合抗菌肽在畢赤酵母中的表達水平及活性檢測Fig. 6 Expression level and antibacterial activity of hybrid antibacterial peptide magaininⅡ-PGLa. (A)Expression level of hybrid antibacterial peptide in Pichia pastoris. (B) Antibacterial activity of hybrid antibacterial peptide to E. coli.

3 討論

抗菌肽 magaininⅡ是非洲爪蟾皮膚顆粒腺分泌的一種抗菌肽，對細菌、真菌、原蟲、腫瘤等都具有一定殺傷作用[4-5,8,19,28]。在臨床上，抗菌肽magaininⅡ的衍生物Pexiganan (MSI-78)用于治療糖尿病足潰瘍 (Diabetic foot ulcers)，已完成了3期臨床[36]。

據(jù)文獻報道同是來源于非洲爪蟾皮膚的抗菌肽magaininⅡ和PGLa抗菌活性具有一定協(xié)同作用[28-33]，Katsumi Matsuzaki等預(yù)測Magainin和PGLa形成一種對膜有很強通透能力的，由平行的螺旋線組成的異源二聚體，其進一步研究顯示雜合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa抑菌活性明顯高于單獨或者等摩爾混合的兩種抗菌肽，且在膜表面形成螺線管蟲洞的速率順序是magaininⅡ/PGLa 等 摩 爾 混 合 ≥PGLa＞magaininⅡ，而螺線管蟲洞的持續(xù)時間則是magaininⅡ＞magaininⅡ/PGLa等摩爾混合＞PGLa[29-30]。固相核磁共振研究表明，在低濃度下抗菌肽PGLa以單體形式存在，在膜表面處于表面態(tài) (Surface-state)，當PGLa濃度升高時，在膜表面處于傾斜態(tài) (Tilted-state)，在抗菌肽magaininⅡ存在時兩者形成異源二聚體，處于插入狀態(tài) (Inserted-state)，進而在膜表面形成穩(wěn)定的螺線管蟲洞結(jié)構(gòu)，使細菌內(nèi)外的滲透壓發(fā)生改變，從而起到協(xié)同殺菌的作用[33]。

直接從生物體內(nèi)分離和純化天然抗菌肽的過程非常復(fù)雜，而且生產(chǎn)成本高。利用細菌或畢赤酵母生產(chǎn)抗菌肽有可能實現(xiàn)抗菌肽的工業(yè)化生產(chǎn)，而且可以利用基因工程技術(shù)對抗菌肽進行有目的的改造，使抗菌肽的活性升高，溶血性降低，從而在一定程度上克服抗菌肽分子量小、易降解等困難。

本文主要探討了抗菌肽 magaininⅡ的表達策略，首先采取原核 GST融合表達抗菌肽magaininⅡ以及 DP-magaininⅡ，并分別用蛋白酶和稀酸進行切割純化。進而采取畢赤酵母分泌表達雜合抗菌肽magaininⅡ-PGLa。我們成功在細菌中對抗菌肽magaininⅡ?qū)崿F(xiàn)了高效表達，原核融合表達雖然表達量比較高，但是一般處于天然狀態(tài)的抗菌肽才具有最佳抗菌活性，而在此過程中用于切割的蛋白酶成本太高。為克服這一問題，我們嘗試利用天門冬氨酸-脯氨酸二聯(lián)氨基酸中肽鍵對酸的敏感性，設(shè)計了含有這兩個氨基酸的抗菌肽 DP-magininⅡ，在初步純化后進行了切割檢測，結(jié)果顯示利用酸切有切割效果，但尚需進一步優(yōu)化條件，同時構(gòu)建抗菌肽magaininⅡ的串聯(lián)體，以獲得大量抗菌肽。

本研究還設(shè)計和構(gòu)建了雜合抗菌肽magaininⅡ-PGLa載體，并在畢赤酵母中進行了表達實驗，獲得了預(yù)期的結(jié)果，通過ELISA分析抗菌肽his/flag-magaininⅡ-PGLa成功獲得了分泌表達。magaininⅡ-PGLa在酵母菌菌株1中比其他兩個菌株分泌表達量高，原因可能是整合到酵母染色體上的目的基因拷貝數(shù)不同，從而使同一基因在不同菌株中的表達不盡相同?；钚苑治鲲@示雜合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa有一定抗菌活性。下一步需要進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，大量表達magaininⅡ-PGLa雜合抗菌肽并優(yōu)化純化方式，進一步提高抗菌活性，為后續(xù)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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