空化射流條件下酶法制油豆渣蛋白結(jié)構(gòu)與理化特性研究

李 楊 和銘鈺 吳長玲 王中江 滕 飛

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030； 2.哈爾濱市食品產(chǎn)業(yè)研究院， 哈爾濱 150028)

0 引言

酶法制油是一種新型環(huán)保提油技術(shù)，可以從大豆中同步提取植物油及蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)提油技術(shù)相比，酶法制油具有處理?xiàng)l件溫和、產(chǎn)品品質(zhì)高、操作安全、環(huán)境污染小、無溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。隨著酶法制油技術(shù)進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段，其產(chǎn)生的大量加工副產(chǎn)物并未得到充分利用，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，極大地影響了酶法制油技術(shù)的經(jīng)濟(jì)可行性[4-6]。目前，對豆渣的研究主要集中在多糖、膳食纖維、大豆異黃酮等方面，對豆渣蛋白的研究較少[7-9]。研究表明，與很多植物蛋白相類似，豆渣蛋白中含人體所需的氨基酸，具有較低過敏性和較高的蛋白效價(jià)比。因此，酶法制油豆渣蛋白具有很大的發(fā)展?jié)摿10-11]。

空化射流技術(shù)是一種新型物理改性技術(shù)，該技術(shù)集高速?zèng)_擊、高頻振動(dòng)、高速剪切、超微粉碎、瞬時(shí)壓降等多種處理技術(shù)于一體，從而改變生物大分子物質(zhì)的物理、化學(xué)及結(jié)構(gòu)特性，并提高物質(zhì)功能活性。近幾年，有研究指出，空化射流處理對于改善蛋白結(jié)構(gòu)具有顯著功效[12-13]。文獻(xiàn)[14]研究了空化射流調(diào)節(jié)豌豆球蛋白可溶性聚集體的乳化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)微射流加工過程的空穴效應(yīng)導(dǎo)致球蛋白聚集體內(nèi)的結(jié)構(gòu)重排，從而提高了蛋白聚集體的乳液穩(wěn)定性。文獻(xiàn)[15]研究表明，大豆分離蛋白(SPI)在空化射流高剪切處理下，導(dǎo)致大的不溶性聚集體破碎，并形成新的亞基間二硫鍵，從而大大提高了SPI的溶解度和表面疏水性?？栈淞骷夹g(shù)對植物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響，與其他處理技術(shù)相比具有操作簡單、處理時(shí)間短、溫度低和效果獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。目前，采用空化射流對SPI或其他豆類分離蛋白改性的研究已經(jīng)很廣泛，但對豆渣蛋白的影響研究尚未見報(bào)道。

本文運(yùn)用空化射流技術(shù)處理酶法制油豆渣，采用二維及三維熒光光譜法、電泳及掃描電鏡分析不同時(shí)間空化射流處理下豆渣蛋白的構(gòu)象及表觀形態(tài)變化，通過豆渣蛋白界面性質(zhì)、溶解性、氨基酸水合能力、粒度分析及ζ-電位對其功能特性進(jìn)行表征，以明確空化射流對酶法制油豆渣蛋白的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)94%)，市售；堿性蛋白酶，酶活10 000 U/g以上，廣州柏棠貿(mào)易有限公司；Lowry法測溶解度試劑盒，上海荔達(dá)生物科技有限公司；大豆分離蛋白(純度90.21%以上，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.7%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.95%，粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.87%)，山東禹王實(shí)業(yè)(集團(tuán))有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S22-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PL303型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DC-500A型高速多功能粉碎機(jī)，浙江武義鼎藏日用金屬制品廠；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州丹瑞實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器，常州丹瑞實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；PHS-3C型雷磁pH計(jì)，上海精科儀器有限公司；TDL-408型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9146型鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；空化射流均質(zhì)機(jī)，北京中森匯嘉科技發(fā)展有限責(zé)任公司；L-8800型氨基酸分析儀，日本HITACHI公司；Mastersizer 2000型激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI公司。

1.3 方法

1.3.1酶法制油豆渣的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，將市售大豆經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過60目篩，取200 g過篩后的豆粉，按液料比6 mL/g加入蒸餾水，攪拌均勻后放入55℃水浴鍋內(nèi)按照酶法制油進(jìn)行酶解，酶解條件為：酶解溫度55℃、酶解時(shí)間2 h、pH值維持在9.0、堿性蛋白酶Protex6L(8 900 U/mL)添加量為0.5%，用攪拌器邊攪拌邊酶解，酶解結(jié)束后，取出并用1 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0，之后在100℃沸水中滅酶5 min，滅酶后冷卻至室溫(20℃)，在4 500 r/min、4℃條件下離心20 min，離心后去除上層液體，僅保留下層豆渣，并在相同離心條件下按液料比3 mL/g用去離子水將豆渣水洗3遍，之后將豆渣在平板上鋪平后置入55℃鼓風(fēng)干燥箱待質(zhì)量恒定后取出研磨，即得所需酶法制油豆渣。

1.3.2空化射流技術(shù)處理

稱取一定量研磨后的豆渣，按液料比8 mL/g溶于去離子水中，采用空化射流均質(zhì)機(jī)，對其進(jìn)行均質(zhì)處理，處理時(shí)間分別為5、10、15 min，同時(shí)以未經(jīng)過高壓微射流處理(0 min)的樣品作為對照，溫度25℃，壓力0.1 MPa，在4 500 r/min、4℃條件下離心20 min，之后沉淀干燥即可。

1.3.3基本成分測定

粗蛋白含量檢測參照標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5—2016，利用凱氏定氮法；可溶性蛋白含量測定參照標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1250—2006；膳食纖維含量檢測參照標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.88—2014，利用重量法；脂肪含量檢測參照GB 5009.6—2016，利用索氏抽提法；含水率檢測參照GB 5009.3—2016，利用105℃ 恒重法；灰分含量檢測參照GB 5009.4—2016，利用灼燒恒重法。

1.3.4酶法制油豆渣蛋白等電點(diǎn)確定

根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法采用沉淀質(zhì)量法進(jìn)行測定。取過100目篩的豆渣粉50 g，按液料比22 mL/g加入蒸餾水，45℃下用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至9.5，水浴鍋攪拌提取1 h，pH值維持9.5。在8 000 r/min、10 min、4℃條件下離心，去上清液平均分為10份，用1 mol/L HCl溶液分別調(diào)pH值至4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0，靜置2 h后在4℃條件下8 000 r/min 離心10 min，棄去上清液后稱質(zhì)量，重復(fù)一次，繪制沉淀量與pH值的關(guān)系曲線圖，沉淀量最大時(shí)的pH值為豆渣等電點(diǎn)，故等電點(diǎn)為4.6。

1.3.5豆渣蛋白的提取工藝

根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，取100 g豆渣粉用正己烷以液料比6 mL/g混合攪拌1 h，離心(4 500 r/min、20 min、4℃)脫脂，得到脫脂豆粕[19]，將脫脂豆粕按1∶20的質(zhì)量比與水混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，常溫?cái)嚢? h后，將其懸浮液在4℃條件下9 000 r/min離心30 min，取上清液。再用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至豆渣等電點(diǎn)4.6。靜置2 h后在4℃條件下7 000 r/min離心30 min，得蛋白沉淀，用去離子水洗3次，最后取沉淀溶解于水中并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。再在4℃條件下9 000 r/min離心30 min，取上清液，將此蛋白溶液冷凍干燥后研磨即得粉末狀豆渣蛋白。

1.3.6乳化活性和乳化穩(wěn)定性測定

乳化性能的測定根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，取一定體積質(zhì)量濃度為0.005 g/mL的蛋白質(zhì)溶液，加入同體積的葵花籽油，用高速分散器以10 000 r/min的速度高速攪拌1 min，之后分別在0 min和10 min從容器底部移取等分試樣的乳液(50 μL)，以質(zhì)量濃度為0.001 g/mL的SDS(十二烷基硫酸鈉，pH值7.0)稀釋100倍，以SDS溶液為空白，在500 nm下測量稀釋溶液的吸光度，乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)計(jì)算公式為

(1)

(2)

式中A0——初始時(shí)刻的吸光度

N——稀釋倍數(shù)，取100

C——豆渣蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

V——乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)，%

ΔT——時(shí)間差，min

ΔA——ΔT內(nèi)的吸光度差

A10——10 min時(shí)吸光度

1.3.7起泡性和泡沫穩(wěn)定性測定

根據(jù)文獻(xiàn)[21]的發(fā)泡性能測定方法，取50 mL質(zhì)量濃度0.03 g/mL豆渣蛋白溶液用高速分散器以10 000 r/min的速度攪打1 min，用10 mL蒸餾水清洗刀具，洗液小心并入起泡液中，記錄攪打前后的體積。起泡能力用體積增加的百分比表示。隨后，將攪打起泡的樣品靜置10、20、30 min，記錄不同時(shí)間段的泡沫體積，其中所有實(shí)驗(yàn)平均測量3次。起泡性指數(shù)(FC)和泡沫穩(wěn)定性指數(shù)(FS)計(jì)算公式為

(3)

(4)

式中V1——攪打前體積，mL

V2——攪打后體積，mL

V3——放置一段時(shí)間后泡沫體積，mL

1.3.8溶解性測定

參照文獻(xiàn)[22]的方法并加以改進(jìn)。將豆渣蛋白溶于去離子水中，分別配成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04 g/mL的豆渣蛋白溶液。精確稱取10 mL豆渣蛋白溶液，在4 500g條件下離心15 min。上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，應(yīng)用Lowry法測定上清液蛋白含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用凱氏定氮法測定樣品總蛋白含量。溶解度S計(jì)算公式為

式中T1——上清液豆渣蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

T2——總豆渣蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

1.3.9氨基酸分析

根據(jù)文獻(xiàn)[23-24]的測定方法，利用L-8800型氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸分析。

1.3.10粒徑分布及ζ-電位測定

根據(jù)文獻(xiàn)[25]的測定方法，利用Mastersizer 2000型激光粒度儀進(jìn)行粒徑分布及ζ-電位測定。

1.3.11熒光光譜分析

根據(jù)文獻(xiàn)[26-27]的測定方法，使用F-4500型熒光光譜儀測定樣品的熒光光譜。配置50 mL質(zhì)量濃度10 mg/mL的豆渣蛋白溶液，用磷酸鹽緩沖液稀釋100倍后取適量稀釋樣品置于石英比色皿中測定。二維熒光測定參數(shù)為：掃描發(fā)射波長為300～500 nm，激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm；三維熒光光譜的連續(xù)掃描記錄發(fā)射波長為200～500 nm，起始激發(fā)波長為200 nm，增長間隔為10 nm，掃描16條曲線。

1.3.12掃描電子顯微鏡觀察

參照文獻(xiàn)[28]的方法并略作修改。稱取0.1 g樣品，將其固定在碳帶和鋁短柱上并在真空下涂覆鉑-鉛(Pt-Pb)，于3 kV下觀察豆渣蛋白微觀結(jié)構(gòu)圖像。

1.3.13十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

參照文獻(xiàn)[29]的方法，并稍作修改。將SPI溶液以質(zhì)量濃度1.5 mg/mL懸浮在磷酸鹽緩沖液(0.02 mmol/L，pH值 6.0)中。將SPI溶液(1 mL)加入4 mL樣品緩沖液中，煮5 min。將Bio-RadMiniProtean3系統(tǒng)用作不連續(xù)的緩沖液系統(tǒng)，在5%堆積凝膠和12%分離凝膠上，恒定電流設(shè)置為25 mA，持續(xù)約1.5 h。蛋白帶用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，然后用7%的乙酸(甲醇、乙酸、水體積比227∶37∶236)脫色。將預(yù)先染色的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記(10～170 ku)在同一凝膠上電泳，以鑒定染色的凝膠中蛋白質(zhì)條帶的分子質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

在本研究中，所有收集的數(shù)據(jù)均為3次測定的平均值及3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，利用SPSS Statistics 22軟件，采用方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較，p<0.05為顯著性差異。采用Origin 9.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣基本成分分析

由表1可知，豆渣中主要成分是膳食纖維，其次就是蛋白質(zhì)。未處理及空化射流處理(5、10、15 min)的豆渣蛋白水溶性蛋白質(zhì)量占粗蛋白百分比分別為71.63%、73.21%、74.59%及74%。與未處理豆渣蛋白相比，水溶性蛋白含量顯著提高，表明空化射流處理可以使豆渣蛋白中的不溶性成分轉(zhuǎn)為可溶。

表1 豆渣基本成分含量Tab.1 Composition of soybean residue protein %

2.2 豆渣蛋白粒徑及ζ-電位分析

圖1(圖中相同圖例不同字母表示處理間差異顯著，下同)為不同空化射流處理時(shí)間對豆渣蛋白粒徑分布、體積平均粒徑D[4,3]及ζ-電位的影響。與未處理豆渣蛋白相比，經(jīng)空化射流處理的豆渣蛋白溶液顯示出更寬的顆粒分布，體積平均粒徑D[4,3]較低，ζ-電位絕對值升高，表明空化射流處理使豆渣蛋白溶液體系更加穩(wěn)定。當(dāng)空化微射流處理10 min后，D[4，3]最低，為(470.10±8.70)nm，ζ-電位絕對值最高，為(27.4±0.83)mV。另外，隨著處理時(shí)間的延長，豆渣蛋白粒徑先降低后升高，ζ-電位絕對值先增加后降低。原因是空化射流處理過程中的強(qiáng)力剪切、高速?zèng)_擊及高頻振動(dòng)等作用能有效減小豆渣蛋白的粒徑，增加蛋白質(zhì)上的負(fù)表面電荷，增強(qiáng)顆粒間靜電排斥，破壞現(xiàn)有蛋白質(zhì)聚集體，并抑制進(jìn)一步聚集，粒子間的相互排斥力增大，體系穩(wěn)定性增強(qiáng)。隨著處理時(shí)間的延長，過度的處理在一定程度上促使蛋白分子間發(fā)生聚集，蛋白質(zhì)變性，高頻的聚集現(xiàn)象和極高的能量密度使豆渣蛋白產(chǎn)生了過處理現(xiàn)象，使豆渣蛋白發(fā)生熱聚集，故粒徑變大，ζ-電位絕對值降低，體系穩(wěn)定性下降[30]。

圖1 不同空化射流處理時(shí)間對豆渣蛋白粒徑分布、體積平均粒徑D[4,3]及ζ-電位的影響Fig.1 Effects of different cavitation jet treatment times on particle size distribution and volume mean diameter D[4,3] and ζ-potential of soybean residue protein

2.3 豆渣蛋白微觀結(jié)構(gòu)分析

通過掃描電子顯微鏡可以更好地觀察豆渣蛋白表觀結(jié)構(gòu)的顯著變化。由圖2a、2c可以看出，未處理的豆渣蛋白呈聚集狀態(tài)，且形狀不規(guī)則，大小不均一。當(dāng)經(jīng)過10 min的空化射流處理后發(fā)現(xiàn)，豆渣蛋白的尺寸變小，質(zhì)地也更松散，表明空化射流處理使豆渣蛋白部分展開，使聚集狀態(tài)的豆渣蛋白分散。

圖2 豆渣蛋白掃描電子顯微鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy of soybean residue protein

2.4 豆渣蛋白溶解性分析

由于溶解度是蛋白質(zhì)變性和聚集最實(shí)用的衡量指標(biāo)，因此它是蛋白質(zhì)功能的良好指標(biāo)，溶解度的改變可以改善豆渣蛋白的功能特性[31]。不同空化射流處理時(shí)間下豆渣蛋白的溶解度變化如圖3所示，對比發(fā)現(xiàn)在同一蛋白質(zhì)量濃度下空化射流處理后豆渣蛋白溶解度均有所提升，并隨著處理時(shí)間的延長，溶解度呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢。這主要是因?yàn)?，空化射流處理產(chǎn)生的空穴效應(yīng)使蛋白質(zhì)分子發(fā)生解折疊，結(jié)構(gòu)展開，親水性提高，疏水基團(tuán)暴露；另一方面，空化射流的剪切作用使豆渣蛋白粒徑減小，蛋白比表面積增加，增加了蛋白質(zhì)和水分子之間的相互作用，豆渣蛋白溶解性得到改善[32-33]。但隨著處理的繼續(xù)進(jìn)行，分子碰撞作用不再增加，蛋白質(zhì)部分變性，可溶性聚集體變?yōu)椴蝗苄猿恋?，?dǎo)致豆渣蛋白溶解度降低。文獻(xiàn)[34]研究發(fā)現(xiàn)，在較短的處理時(shí)間內(nèi)，旋轉(zhuǎn)空化作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)的解折疊和構(gòu)象變化，最初不溶的沉淀物形成可溶性聚集體，提高了商業(yè)SPI的溶解度，從而驗(yàn)證了本研究的結(jié)果。

圖3 不同空化射流處理時(shí)間對豆渣蛋白溶液溶解度的影響Fig.3 Effect of different cavitation jet treatment times on solubility of soybean residue protein solution

2.5 豆渣蛋白界面性質(zhì)分析

圖4為不同空化射流處理時(shí)間下豆渣蛋白的界面性質(zhì)。結(jié)果表明，空化射流可以顯著改善豆渣蛋白的起泡性和乳化性(p<0.05)。隨著空化射流時(shí)間的延長，豆渣蛋白的起泡性和乳化性均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，處理時(shí)間10 min最佳。

圖4 不同空化射流處理時(shí)間對豆渣蛋白界面性質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different cavitation jet treatment times on interfacial properties of soybean residue protein

泡沫形成受3個(gè)因素影響：分子在空氣-水界面的轉(zhuǎn)運(yùn)、滲透和重組。因此，要表現(xiàn)出良好的發(fā)泡性，蛋白質(zhì)必須能夠在空氣-水界面遷移，在界面處展開和重新排列[33]。文獻(xiàn)[35]研究表明，更大的溶解度有利于在界面處形成多層粘性蛋白膜，以提高泡沫的容量和穩(wěn)定性。空化射流作用使蛋白質(zhì)展開，遷移至空氣-水界面的蛋白分子數(shù)量增多，溶解性增強(qiáng)，分子交聯(lián)程度增加，蛋白質(zhì)分子變得更加柔軟，促進(jìn)了泡沫的形成，從而增加了豆渣蛋白的發(fā)泡能力和發(fā)泡穩(wěn)定性。

乳化性的增加是因?yàn)槎乖鞍自诳栈淞骺栈图羟凶饔孟?，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到破壞從而使肽鏈得到進(jìn)一步伸展，疏水基團(tuán)朝向油相形成液膜來固定油滴，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子在水-油界面上的更有效吸收。但是隨著處理時(shí)間的延長，蛋白分子間重新形成難溶性分子聚集體，分子間碰撞停止，無法達(dá)到良好的親水-疏水平衡，導(dǎo)致起泡性和乳化性降低[36-38]。FC、FS、EAI及ESI隨空化射流時(shí)間的變化與溶解度的變化一致，這證實(shí)溶解度的增加有助于乳化能力和起泡性的提高。

2.6 豆渣蛋白氨基酸分析

表2為SPI、未處理及經(jīng)空化射流處理的豆渣蛋白氨基酸組成分析。結(jié)果表明豆渣蛋白與SPI的氨基酸組成相似，其主要組成均為谷氨酸。豆渣蛋白中人體必需氨基酸含量高于SPI，且經(jīng)空化射流處理后含量增加(SPI、未處理及空化射流處理下豆渣蛋白的必需氨基酸含量分別為20.88%、21.64%及25%)，故豆渣蛋白具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。水合能力α(g/g)的計(jì)算公式為

α=fC+0.4fF+0.2fN

(5)

式中fC、fF、fN——蛋白質(zhì)分子中帶電、極性和非極性殘基所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表2 氨基酸分析Tab.2 Amino acid (AA) analysis %

如表2所示，SPI、未處理及空化射流處理下豆渣蛋白的疏水性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為29.17%、30.26%及33.03%，豆渣蛋白所含疏水性氨基酸含量高于SPI。經(jīng)計(jì)算，SPI的α為0.82 g/g，而未處理及經(jīng)空化射流處理的豆渣蛋白α分別為0.75、0.77 g/g?？梢缘贸龆乖鞍捉Y(jié)合水能力低于SPI，且空化射流處理的豆渣蛋白水合能力比未處理的高，與上述豆渣蛋白溶解度變化趨勢一致。

2.7 豆渣蛋白SDS-PAGE分析

樣品的SDS-PAGE譜圖如圖5所示，其中A、B、 C分別表示未處理豆渣蛋白、空化射流處理10 min的豆渣蛋白和SPI，M表示蛋白質(zhì)marker。豆渣蛋白與SPI的組成類似，主要由大豆球蛋白(11S)和β-伴大豆球蛋白(7S)組成。7S是3種亞基通過非共價(jià)鍵的結(jié)合，即α′、α和β，而11S是由6個(gè)亞基組成，酸性(A)和堿性(B)亞基經(jīng)過一個(gè)二硫鍵連接為AB亞基。與未處理的豆渣蛋白(圖5中A)相比，空化射流處理10 min后，α′、α強(qiáng)度降低，分子質(zhì)量由高向低轉(zhuǎn)移。這表明空化射流處理破壞了氫鍵和疏水鍵，導(dǎo)致分子質(zhì)量改變和降低，進(jìn)而增加蛋白質(zhì)與水分子之間的相互作用，氨基酸內(nèi)部親水基團(tuán)暴露于水中，進(jìn)而豆渣蛋白的溶解度提高[39]。

圖5 豆渣蛋白的SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE image of soybean residue protein

2.8 豆渣蛋白二維熒光光譜分析

大豆蛋白的熒光主要來自于Trp殘基，且其熒光變化值可直接反映大豆蛋白中Trp殘基本身及其周圍環(huán)境變化，因此可以從熒光的波動(dòng)確定蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。研究表明最大熒光發(fā)射波長λmax與Trp殘基所處的微環(huán)境有關(guān)，λmax小于330 nm表示Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性環(huán)境中，當(dāng)λmax大于330 nm時(shí)表明Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中[27，40]。如圖6所示，空化射流處理0～15 min的豆渣蛋白λmax分別為342.6、344、350.8、346.6 nm，由此可知本研究所測試豆渣蛋白Trp殘基分布趨向于蛋白分子外部環(huán)境。與未處理豆渣蛋白相比，空化射流處理的豆渣蛋白發(fā)生了紅移，隨著處理時(shí)間的延長，紅移遷移量先增加后降低。并且當(dāng)處理時(shí)間為10 min時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。這種結(jié)果主要?dú)w因于空化射流使豆渣蛋白的空間構(gòu)象改變，結(jié)構(gòu)展開，最初掩埋在分子內(nèi)部疏水環(huán)境的Trp殘基逐漸暴露在外部的親水環(huán)境中，肽鏈結(jié)構(gòu)舒展[41-42]，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度改變和位移。但隨著處理時(shí)間延長，大豆蛋白的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)一步展開，蛋白分子間的次級(jí)鍵和疏水作用等使蛋白發(fā)生聚集，生色基團(tuán)轉(zhuǎn)移到疏水環(huán)境中，使熒光強(qiáng)度下降，λmax藍(lán)移。

圖7 豆渣蛋白體系三維熒光強(qiáng)度等高線圖Fig.7 3D-contour line figures of soybean residue protein

圖6 不同空化射流處理時(shí)間豆渣蛋白的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of soybean residue protein at different cavitation jet treatment times

2.9 豆渣蛋白三維熒光光譜分析

三維熒光光譜法是一種用于提供蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)信息的有力方法。圖7為不同空化射流處理時(shí)間下豆渣蛋白的三維熒光光譜圖，并繪出相應(yīng)的強(qiáng)度等高線圖。其中兩個(gè)形如山脊的小峰為瑞利一級(jí)散射峰Peak a(λex=λem，λex表示激發(fā)波長，λem表示發(fā)射波長)及二級(jí)散射峰Peak b(2λex=λem)；Peak 1為蛋白質(zhì)Trp和Tyr殘基的特征峰(λex=280 nm，λem= 340 nm)；Peak 2主要代表多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的特征峰(λex= 230 nm，λem= 350 nm)，這些都是熒光峰的典型特征峰[43]。

通過對比可知，經(jīng)空化射流處理的豆渣蛋白瑞利一級(jí)散射峰Peak a熒光強(qiáng)度顯著高于未處理豆渣蛋白(p<0.05)，并且隨著處理時(shí)間的延長，豆渣蛋白的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因是空化射流作用帶來的分子碰撞使豆渣蛋白形成部分大粒徑的可溶性聚集體，光散射作用增強(qiáng)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的瑞利衍射峰。當(dāng)作用時(shí)間超過10 min后，這種分子碰撞停止，故熒光強(qiáng)度反而下降[44]。

熒光特征峰Peak 1及 Peak 2主要顯示了Trp殘基和Tyr殘基的光譜特性。未處理及不同空化射流處理時(shí)間(5、10、15 min)的豆渣蛋白的熒光特征峰Peak 1強(qiáng)度分別為189.6、225、278.8及218.3。顯然，經(jīng)過空化射流處理后熒光特征峰Peak 1強(qiáng)度高于未處理，這主要是由于空化射流處理使蛋白質(zhì)分子伸展，粒徑減小導(dǎo)致其疏水結(jié)合及離子結(jié)合被切斷，非極性基團(tuán)暴露，Trp和Tyr趨向暴露態(tài)， 氫鍵作用逐漸減小，故熒光強(qiáng)度呈上升趨勢變化；而當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到10 min后，豆渣蛋白分子間碰撞作用停止，氫鍵作用反而增大，豆渣蛋白部分變性，蛋白發(fā)生聚集，形成不溶性聚集體，使熒光強(qiáng)度下降。

另外對比熒光特征峰Peak 2，未處理及不同空化射流空化射流處理時(shí)間(5、10、15 min)的豆渣蛋白的熒光特征峰Peak 2強(qiáng)度分別為99.53、118.9、107.3及106.2。表明空化射流作用使熒光特征峰Peak 2的區(qū)域面積發(fā)生變化，豆渣蛋白多肽鏈的骨架伸展，蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水基團(tuán)逐漸暴露。但隨著時(shí)間的延長，熒光特征峰Peak 2強(qiáng)度有所降低，表明豆渣蛋白分子間作用降低，促使暴露態(tài)疏水性氨基酸重新包埋在分子內(nèi)部[45-46]。但空化射流作用并未顯著改變豆渣蛋白的酪氨酸特征峰熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)束語

通過對比不同空化射流處理時(shí)間下酶法制油豆渣蛋白的氨基酸組成、粒徑、ζ-電位、溶解性、界面性質(zhì)及二維和三維熒光光譜，發(fā)現(xiàn)空化射流作用時(shí)間為10 min時(shí)，效果較好。隨著空化射流處理時(shí)間的延長，豆渣蛋白的粒徑分布、體積平均粒徑D[4,3]先降低后升高、ζ-電位絕對值先升高后降低，空化射流處理后，豆渣蛋白溶解性、起泡性及乳化性均有所改善。經(jīng)氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，酶法制油豆渣蛋白和SPI的氨基酸組成相似，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，且豆渣蛋白所含人體必需氨基酸及疏水性氨基酸含量均高于SPI。熒光光譜的變化表明，空化射流導(dǎo)致豆渣蛋白構(gòu)象改變，色氨酸和酪氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了變化，最初掩埋在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)逐漸暴露。因此，空化射流技術(shù)可以有效改善酶法制油豆渣蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性，本研究可為空化射流技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域提供理論指導(dǎo)。