知柏地黃湯對(duì)大鼠血清及尿液差異代謝物的影響

葉麗 陳仙英 陳宇 徐莉?

知柏地黃丸為眾多六味地黃丸加減方之一，由六味地黃丸（熟地黃，山茱萸，山藥，澤瀉，牡丹皮，茯苓）加知母，黃柏而組成，加強(qiáng)其滋陰清相火的作用。本方的主要功效是滋陰降火，主治肝腎陰虛，虛火上炎證。多用于陰虛火旺，潮熱盜汗，口干咽痛，耳鳴，小便短赤等癥?，F(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)，知柏地黃丸有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌、血糖血脂等［1-2］諸多藥理作用。作者應(yīng)用UPLC-MS測定知柏地黃湯組與空白對(duì)照組大鼠血清、尿液代謝物，以及這些差異代謝物所在通路，進(jìn)一步闡明知柏地黃湯對(duì)大鼠機(jī)體的一些作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)儀器：Centrifuge 5417R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；超低溫冰箱（日本SANYO公司）；1260 HPLC-6520 Q-TOF/MS、Eclipse Plus C18色譜柱、Mass Hunter軟件、Mass Profiler Professional（MPP）均來自（美國安捷倫科技有限公司）。（2）實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：知母24g，黃柏24g，熟地黃24g，山茱萸12g，山藥12g，澤瀉9g，茯苓9，丹皮9g，以述中藥材均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供。中藥水煎劑：上述中藥材以單蒸水800ml煎煮1h，共煎煮2次，然后將2次的中藥水煎劑混合，再以R202型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將其濃縮成1g/ml。質(zhì)譜參比液（美國安捷倫科技有限公司）；質(zhì)譜校準(zhǔn)液（美國安捷倫科技有限公司）；c色譜級(jí)（阿拉丁公司）；甲醇、乙腈均為色普級(jí)（美國Tedia公司）。（3）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Sprague Dawley（SD）大鼠，清潔級(jí)，雌性，6～8周齡，體重（150±20）g，共26只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，全封閉清潔級(jí)狀態(tài)下隔離飼養(yǎng)，室溫20℃，相對(duì)濕度40%～60%，每日光照12h，自由攝食、飲水。

1.2 方法 （1）給藥和樣本收集：將26只SD大鼠隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組（14只）和知柏地黃湯組（12只）。兩組大鼠均以普通飲食喂養(yǎng)，其中正常對(duì)照組予生理鹽水灌胃0.1ml/（10g·d），知柏地黃湯組大鼠予知柏地黃湯水煎劑（1g/ml）進(jìn)行灌胃0.1ml/（10g·d）。（2）尿液樣本收集：于實(shí)驗(yàn)第21天分別收集大鼠尿液，共收集2次；尿液樣品加入疊氮化鈉后保存于-80℃冰箱，以用于尿液代謝組學(xué)研究。（3）血清樣本收集：大鼠給藥21d后，采用腹腔靜脈取血，全血靜置30min后，采用3000r/min×10min，4℃離心，取血清-80℃保存，以用于后續(xù)血清代謝組學(xué)檢測。（4）樣本處理：①尿液樣本前處理：室溫條件下解凍“樣本收集”所得尿樣，取150μl尿樣置于有450μl超純水的離心管中，渦旋1min充分混勻，然后采用12000r/min×10min，4℃低溫高速離心后，取上清液用0.22μm微孔濾膜過濾，棄去初始濾液，樣品即可進(jìn)行LC/MS分析。②血液樣本前處理：在室溫下解凍采集血清樣品，取150μl置于離心管中，加入450μl乙腈沉淀蛋白，渦旋30s，在靜置10min后，采用12000r/min×10min，4℃低溫高速離心，取300μl上清液用去離子水1：1稀釋，稀釋后的600μl血清樣品用0.22μm尼龍膜過濾，棄去初始濾液，用于液相質(zhì)譜分析。（5）色譜與質(zhì)譜條件優(yōu)化：經(jīng)過對(duì)色譜條件的考察，最終確定的色譜條件：Eclipse Plus C18色譜柱（2.1×50mm，1.8μm）；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度控制在5℃；柱溫為35℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈溶液，流速：0.2ml/min，后運(yùn)行時(shí)間為4min；進(jìn)樣量為5μl；為樣品的改善分離的效果和檢測靈敏度，實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，洗脫梯度：0min，95%A 5%B；4min，90%A 10%B；17min，55%A 45%B；22min，5%A 95%B。優(yōu)化后質(zhì)譜的主要參數(shù)為：采用電噴霧離子源（ESI+）；采集范圍：m/z 50～1000；干燥氣：N2，流速為10L/min，干燥氣溫度為350℃；毛細(xì)管電壓、碎裂電壓、錐孔電壓分別為4000V、180V、60V；霧化氣壓力為310KPa。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Centroid模式保存，采集速率為2spectrum/s。在分析過程中，使用質(zhì)譜參比液，對(duì)儀器的運(yùn)行進(jìn)行監(jiān)測，校準(zhǔn)儀器的實(shí)時(shí)質(zhì)量偏差。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Mass Profiler軟件（Agilent公司），分析模型組和對(duì)照組的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。并在EXCEL2010軟件中進(jìn)行歸一化及后期編輯，將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量（rt_mz，即保留時(shí)間_質(zhì)荷比）、分子量（mass）觀察量（樣本）和峰強(qiáng)。本項(xiàng)目樣本在該模式下共得到1069個(gè)features。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P軟件（版本13.0）進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析（PCA）和有監(jiān)督的偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別。并進(jìn)一步采用有監(jiān)督式方法OPLS-DA進(jìn)行建模分析。采用 OPLS-DA模型的VIP（Variable Importance in the Projection）值（閾值 ＞1），并結(jié)合 t-test的 P 值（P＜0.05）來尋找差異性表達(dá)代謝物。差異性代謝物的定性方法為：搜索在線數(shù)據(jù)庫（Metlin）（比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量mass）。將得到的總差異物質(zhì)輸入到MetaboAnalyst 3.0中，獲得這些差異物質(zhì)所在的代謝通路。

2 結(jié)果

知柏地黃湯組和對(duì)照組小鼠血清和尿液的典型UPLC/MS總離子色譜圖見圖1。先行血清和尿液樣本的主成分分析（PCA），以顯示評(píng)分圖間的組間分離趨勢，然后OPLS-DA模型知柏地黃湯組與對(duì)照組間的分離更清晰。根據(jù)變化的代謝物，通過搜索KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫鑒定相關(guān)途徑。在血清樣品中，三種代謝途徑發(fā)生明顯變化，包括脂肪酸生物合成，甘油磷脂代謝和亞油酸代謝途徑。其中知柏地黃湯組相對(duì)于空白組棕櫚酸、亞油酸、油酸含量下降，而溶血磷 脂 膽 堿 LysoPC［16：1（9Z）］、LysoPC（14：0）、LysoPC（20：0）、LysoPC（16：0）、LysoPC［18：2（9Z，12Z）］、LysoPC［20：4（5Z，8Z，11Z，14Z）］上升。在尿液樣品中，發(fā)現(xiàn)纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑，甘油磷脂代謝和苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成均有顯著變化。知柏地黃湯組中的苯丙酮酸、亮氨酸、纈氨酸、磷酸膽堿含量相對(duì)空白組上升。

圖1 血清、尿液樣本離子流色譜圖

3 討論

纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸生物合成有11種代謝物，本研究在該途徑中涉及2種代謝物。其中亮氨酸和纈氨酸均為支鏈氨基酸（BACC），不僅是必需氨基酸，也是重要的營養(yǎng)分子。涉及胰島素信號(hào)、骨骼肌能量調(diào)節(jié)和肌肉蛋白合成等重要生物過程。BACC主要在肌肉組織中代謝，使其在肌肉細(xì)胞氧化同時(shí)產(chǎn)生能量ATP。其可以更快的轉(zhuǎn)氨酶和完全氧化，三磷酸腺苷（ATP）的氧化比其他氨基酸高。研究表明，亮氨酸可以激活雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路，增加蛋白質(zhì)合成和抑制蛋白質(zhì)分解代謝［3-5］，這在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮作用。 BACC在骨骼肌的內(nèi)源性合成中為谷氨酰胺提供α-氨基［6］，而谷氨酰胺被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)細(xì)胞的主要能量底物［7］，因此BACC也可以被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)的一部分。據(jù)報(bào)道，纈氨酸和亮氨酸缺乏可以抑制小鼠的正常免疫功能［8］。羊可以加入亮氨酸和α-KLC，調(diào)節(jié)其T淋巴細(xì)胞亞群的免疫功能［9］。因此，亮氨酸在體內(nèi)可以用于蛋白質(zhì)的合成，在特殊的生理期可以作為能量來源，調(diào)節(jié)免疫功能。臨床中的一些上火癥狀所表現(xiàn)出的炎癥反應(yīng)，這些致炎因子對(duì)機(jī)體的攻擊而產(chǎn)生一些免疫功能紊亂。而知柏地黃湯的主要功效是滋陰降火，服用后使機(jī)體亮氨酸、纈氨酸含量增多，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，緩解炎癥反應(yīng)，從而起到降火的作用。

另有較多研究表明，BCAA在脂質(zhì)代謝中起重要作用。在缺乏亮氨酸的情況下，白脂肪組織中激素敏感性脂肪酶（HSL）介導(dǎo)的脂質(zhì)動(dòng)員增強(qiáng)，褐色脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）的表達(dá)水平升高，脂肪含量迅速降低［10］。BCAA的強(qiáng)化攝入可以降低人體肥胖的風(fēng)險(xiǎn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明飼料補(bǔ)充劑BCAA可以降低飼料攝入量和體重［11-12］。BCAA分解代謝的重要酶BCAT激活和運(yùn)動(dòng)的肌糖原分解同步，表明補(bǔ)充BCAA有可能加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)后的脂質(zhì)氧化，并在提供能量的作用過程中［13］。這表明BCAA不僅作為能源，且在運(yùn)動(dòng)中也加強(qiáng)了脂質(zhì)的氧化分解。而甘油磷脂途徑相關(guān)代謝物相對(duì)含量增加。可能表明身體脂肪儲(chǔ)存減少，并通過消耗甘油磷脂途徑相關(guān)物質(zhì)，刺激身體的能量消耗。

知柏地黃湯組大鼠體重與對(duì)照組比較有所降低，可能與纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸生物合成途徑和甘油磷脂途徑代謝物含量增加有關(guān)。而知柏地黃湯組尿液中纈氨酸和亮氨酸的增加可進(jìn)一步證實(shí)知柏地黃湯能夠提供氧化能量，提高機(jī)體抗氧化能力，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，提高免疫功能。這為臨床使用知柏地黃湯提供更多的藥理依據(jù)。

［1］ 史正剛,于霞,張士卿.知柏地黃丸對(duì)腎上腺皮質(zhì)激素致腎陰虛幼齡大鼠免疫功能的影響.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2006,12(1):62-64.

［2］ 陳光娟,湯臣康,王德華. 知柏地黃丸對(duì)小鼠血糖的影響.中藥藥理與臨床,1993(4):2-4.

［3］ Kimball SR,Jefferson LS. New functions for amino acids:effects on gene transcription and translation. American Journal of Clinical Nutrition,2006,83(2):500S.

［4］ Louard RJ,Barrett EJ,Gelfand RA. Effect of infused branched-chain amino acids on muscle and whole-body amino acid metabolism in man. Clinical Science,1990,79(5):457-66.

［5］ Nair KS,Schwartz RG,Welle S. Leucine as a regulator of whole body and skeletal muscle protein metabolism in humans. American Journal of Physiology,1992,263(1):928-34.

［6］ Newsholme EA,Calder PC. The proposed role of glutamine in some cells of the immune system and speculative consequences for the whole animal. Nutrition,1997,13(7-8):728-730.

［7］ Newsholme P,Curi R,Curi TCP,et al. Glutamine metabolism by lymphocytes,macrophages,and neutrophils:its importance in health and disease. Journal of Nutritional Biochemistry,1999,10(6):316.

［8］ Petro TM,Bhattacharjee JK. Effect of dietary essential amino acid limitations upon the susceptibility to Salmonella typhimurium and the effect upon humoral and cellular immune responses in mice.Infection & Immunity,1981,32(1):251-9.

［9］ Kuhlman G,Roth J A,Nissen S. Effects of alpha-ketoisocaproate on adrenocorticotropin-induced suppression of lymphocyte function in sheep. American Journal of Veterinary Research,1991, 52(3):388-392.

［10］ Cheng Y,Meng Q,Wang C,et al. Leucine deprivation decreases fat mass by stimulation of lipolysis in white adipose tissue and upregulation of uncoupling protein 1 (UCP1) in brown adipose tissue. Diabetes,2010,59(1):17.

［11］ Qin LQ,Xun P,Bujnowski D,et al. Higher branched-chain amino acid intake is associated with a lower prevalence of being overweight or obese in middle-aged East Asian and Western adults. Journal of Nutrition,2011,141(2):249.

［12］ Zhang Y,Guo K,Leblanc RE,et al. Increasing dietary leucine intake reduces diet-induced obesity and improves glucose and cholesterol metabolism in mice via multimechanisms. Diabetes,2007, 56(6):1647-1654.

［13］ Gualano AB,Bozza TL,Campos D,et al.Branched-chain amino acids supplementation enhances exercise capacity and lipid oxidation during endurance exercise after muscle glycogen depletion.Journal of Sports Medicine and Physical fitness,2011,51(1):82-88.