阿帕替尼抑制胃癌細胞株MGC-803增殖的機制研究

陳佳輝 徐志遠 汪麗菁 倪益秀 孫建城 程向東?

胃癌是病死率最高的惡性腫瘤之一［1］。我國進展期胃癌發(fā)病率占胃癌的60%～80%，現(xiàn)有治療手段5年生存率僅20%［2］。阿帕替尼是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，主要針對血管內(nèi)皮細胞上的VEGFR-2受體，通過抑制腫瘤新生血管的形成，達到抗腫瘤的目的［3-5］。研究表明，阿帕替尼在胃癌治療中能有效延長二期化療失敗患者的無進展生存期（PFS）和總生存率（OS）［6］。2015年12月至2016年5月作者通過實驗研究，探討阿帕替尼通過抑制VEGFR2-PLCERK1/2通路關鍵蛋白磷酸化，抑制胃癌細胞株MGC-803增殖及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 Forma ClassⅡA2生物安全柜（Thermo美國）；Forma 3111 細胞培養(yǎng)箱（Thermo）；Varioskan Flash多功能酶標儀（Thermo）；SORVALL ST 16R離心機（Thermo）；-80℃超低溫冰箱（Thermo）；4℃冰箱（海爾，中國），F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細胞儀（BD）。ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.2 試劑及細胞 阿帕替尼（江蘇恒瑞公司）；胎牛血清（Gibco BRL）；RPMI 1640 培養(yǎng)基，PBS（Thermo）；胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio）；CCK-8試劑盒、Annexin VFITC/IP 凋亡檢查試劑盒、周期檢測試劑盒（康為世紀）。抗β-actin單克隆抗體（Proteintech），抗PKC，p-PKC（α/βⅡThr683/641），p44/42 MAPK（ERK1/2），p-p44/42 MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）和紅色上樣緩沖液（CST）。MGC-803細胞購自中科院上海細胞庫。

1.3 方法 （1）CCK-8法測定細胞毒實驗：取對數(shù)生長期的MGC-803細胞進行鋪板，每孔單細胞懸液180μl（約5000個細胞/孔），接種于96孔板，培養(yǎng)12h后備用。100μM阿帕替尼倍比稀釋7個濃度，實驗組加入20μl不同濃度的阿帕替尼，空白組加入20μl 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后，用吸引器吸去每孔液體，加入RPMI1640：CCK-8=10：1配置的溶液110μl。置于37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中孵育，2h后用酶標儀450nm測定OD值。細胞生存率=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）。所有試驗均重復3次。（2）碘化丙啶染色法（Propidium Staining）測定細胞周期：取對數(shù)生長期的MGC-803細胞進行鋪板，每孔單細胞懸液2ml（6×104/ml），接種于24孔板，置于37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，吸去培養(yǎng)液。80μM阿帕替尼倍比稀釋5個濃度，各實驗組加入2ml含不同濃度阿帕替尼的培養(yǎng)液，空白組加入2ml完全培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24h，小心收集細胞培養(yǎng)液及貼壁細胞，冰浴預冷的95%乙醇固定細胞12h后予碘化丙啶染色。流式細胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況，數(shù)據(jù)經(jīng)計算機處理，得出細胞各周期比例。（3）Annexin-V/PI雙染法測定細胞凋亡：與上述相同方法培養(yǎng)細胞并用阿帕替尼處理后，收集細胞。1000r/min離心5min，沉淀細胞。冰浴預冷的PBS洗滌2次，再次離心沉淀細胞。用去離子水按1∶4稀釋Binding Buffer 250μl重懸細胞，調節(jié)其濃度為1×106/ml；取100μl的細胞懸液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/FITC和10μl 20μg/ml的PI溶液；混勻后于室溫避光孵育15min，然后在反應管中加入400μl PBS，流式細胞儀（FACS），分析數(shù)據(jù)經(jīng)計算機處理，得出細胞凋亡率。（4）Western blot蛋白印記分析：用細胞裂解緩沖液提取總蛋白，并使用增強型BCA蛋白測定試劑盒對蛋白質濃度進行定量。 蛋白質通過8%的SDS-PAGE分離并電轉移至PVDF膜。 將膜用TBS-T中的5%BSA封閉1h，并用相應的一次抗體在4℃下孵育過夜，然后與兔或小鼠二級抗體孵育1h。使用增強型化學發(fā)光試劑在放射自顯影膜上檢測特異性條帶。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 阿帕替尼對MGC803細胞的生長抑制作用 阿帕替尼對MGC803細胞的生長具有明顯抑制作用，其抑制效果呈濃度依賴性，IC50值為（27.9±2.21）μM，而在對照組中未觀察到抑制作用。見圖1。

圖1 阿帕替尼對MGC803細胞的生長抑制

2.2 阿帕替尼對MGC803周期的影響 將0、10、20μM的阿帕替尼作用于MGC-803細胞株24h后，碘化丙啶染色法測定細胞凋亡情況，實驗組與對照組早期凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。見圖2。

圖2 不同濃度的阿帕替尼對MGC-803細胞周期分布影響的比較

2.3 阿帕替尼對MGC803的凋亡的影響 將80μM倍比稀釋的阿帕替尼作用于MGC-803細胞株24h后，Annexin-V/PI雙染法測定細胞凋亡情況，實驗組與對照組早期凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 阿帕替尼對MGC-803細胞凋亡的影響

2.4 阿帕替尼抑制VEGFR2-PLC-ERK1/2通路上關鍵蛋白磷酸化 不同劑量阿帕替尼處理后，tERK1/2、tPLC等蛋白表達水平未發(fā)生明顯變化，而pERK1/2、pPLC等蛋白表達水平降低?？梢姲⑴撂婺峥上抡{VEGFR2-PLC-ERK1/2通路表達。見圖4。

圖4 阿帕替尼對pERK1/2、pPLC等蛋白表達的影響

3 討論

近年來胃癌發(fā)病率和病死率逐年下降，但胃癌仍然是一個重要的公眾健康問題。據(jù)統(tǒng)計，2012年全球胃癌新發(fā)病例約951000萬例，占所有癌癥比例為6.8%。胃癌在中國的發(fā)病率居第二，病死率居第三，是中國四大高發(fā)腫瘤之一［1，2］。對于無法手術切除、復發(fā)或轉移性胃癌患者，最佳支持治療（BSC）預后僅有幾個月［7］?，F(xiàn)有資料顯示，聯(lián)合化療雖然能夠提高疾病的緩解率和患者生存率，但毒性較高，且獲益有限［8］。近年來，多種靶向藥物，如抗表皮細胞生長因子受體1（EGFR）和2（HER-2）單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制藥和血管生成抑制劑，取得較好的臨床效果。相比于傳統(tǒng)細胞毒類抗腫瘤藥物，分子靶向藥物具有高選擇性、高效、低毒副作用等特點［3-5］。與其他類型的惡性腫瘤相比，胃癌靶向治療的發(fā)展相對滯后，但仍取得較大進展，雷莫蘆單抗已通過FDA認證用于胃癌治療，并被NCCN指南推薦［9］。

Sui Peng等證實阿帕替尼可通過抑制膽管癌（EBDC）細胞的VEGFR2受體，而抑制腫瘤細胞自分泌VEGF作用，抑制腫瘤的生長［10］。Lin C等發(fā)現(xiàn)在小細胞肺癌的治療中，阿帕替尼不僅通過細胞毒性發(fā)揮其抗癌作用，且還通過抑制RET / Src信號通路抑制遷移和侵襲［11］。Mi YJ等發(fā)現(xiàn)阿帕替尼可通過抑制轉運功能逆轉ABCB1和ABCG2介導的腫瘤細胞耐藥［12］。

本資料中，與對照組比較，阿帕替尼對胃癌細胞株MGC-803的增殖具有明顯抑制作用，IC50值為（27.9±2.21）μM，抑制作用呈濃度依賴性，當濃度為50μM時，其抑制率可達87%。凋亡受阻和細胞周期紊亂是腫瘤發(fā)生中的重要因素，因此為初步探討其可能存在的機制，作者對試驗組細胞進行凋亡和周期的檢測。誘導細胞凋亡是抗腫瘤治療中的重要環(huán)節(jié)，但本研究中，不同濃度阿帕替尼作用后的MGC-803細胞與對照組相比凋亡率無明顯區(qū)別。因此作者認為阿帕替尼并非通過誘導凋亡抑制MGC-803細胞的生長。同時采用流式細胞儀檢測用阿帕替尼處理24h后MGC-803細胞周期分布，結果顯示，經(jīng)阿帕替尼處理后的細胞被明顯阻滯于G1期，G2期比例減少，S期細胞無明顯變化，差異有統(tǒng)計學意義。

腫瘤細胞的細胞周期紊亂，細胞生長失控，導致細胞無限制增長?；熕幬锟蓪⒛[瘤細胞的周期阻滯于G0/G1期，抑制分裂相關的蛋白質和DNA合成，從而抑制腫瘤細胞的分裂，發(fā)揮抗腫瘤作用［13］。在本資料中，阿帕替尼表現(xiàn)出類似抑制效果，因此作者認為阿帕替尼可通過改變細胞周期發(fā)揮抗腫瘤作用。為進一步證實，對VEGFR2下游的VEGFR2-PLCERK1/2通路進行蛋白免疫印跡試驗。結果顯示，經(jīng)阿帕替尼處理后，磷酸化的PLC與ERK1/2水平明顯下降，且呈濃度依賴性。VEGFR2-PLC-ERK1/2通路被證實與周期調控和細胞增殖關系密切，活化的ERK1/2通過磷酸化激活Jun癌基因（c-Jun），導致DNA合成和細胞增殖［14］。蛋白免疫印跡試驗與細胞增殖抑制和周期受阻結果符合。

綜上所述，阿帕替尼可抑制胃癌細胞株MGC-803的增殖，并將其阻滯于G1期，從而達到抗腫瘤的效果，且該結果與細胞凋亡無關。引起這一現(xiàn)象的原因，可能是阿帕替尼抑制VEGFR2-PLC-ERK1/2通路關鍵蛋白磷酸化，造成MGC-803細胞DNA合成受阻，生長受限。此外，用阿帕替尼長期處理MGC803細胞后，會出現(xiàn)腫瘤細胞耐藥，將進一步研究。

［1］ Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer,2015, 136(5): E359-86.

［2］ Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012.CA Cancer J Clin,2015, 65(2): 87-108.

［3］ Chatterjee S, Heukamp LC, Siobal M, et al. Tumor VEGF:VEGFR2 autocrine feed-forward loop triggers angiogenesis in lung cancer. J Clin Invest,2013,123(4): 1732-1740.

［4］ Xia G, Kumar SR, Hawes D, et al. Expression and significance of vascular endothelial growth factor receptor 2 in bladder cancer. J Urol ,2006,175(4): 1245-1252.

［5］ Zhang Q, Yu C, Peng S, et al. Autocrine VEGF signaling promotes proliferation of neoplastic Barrett's epithelial cells through a PLC-dependent pathway. Gastroenterology ,2014,146(2): 461-472 e6.

［6］ Li J, Qin S, Xu J, et al. Apatinib for chemotherapy-refractory advanced metastatic gastric cancer: results from a randomized,placebo-controlled, parallel-arm, phase II trial. J Clin Oncol,2013, 31(26): 3219-3225.

［7］ Hu Y, Huang C, Sun Y, et al. Morbidity and Mortality of Laparoscopic Versus Open D2 Distal Gastrectomy for Advanced Gastric Cancer: A Randomized Controlled Trial. J Clin Oncol,2016,34(12): 1350-1357.

［8］ Cunningham D, Okines AF, Ashley S. Capecitabine and oxaliplatin for advanced esophagogastric cancer. N Engl J Med, 2010, 362(9):858-859.

［9］ Ajani JA, D'Amico TA, Almhanna K, et al. Esophageal and esophagogastric junction cancers, version 1.2015. J Natl Compr Canc Netw ,2015,13(2): 194-227.

［10］ Peng S, Zhang Y, Peng H, et al. Intracellular autocrine VEGF signaling promotes EBDC cell proliferation, which can be inhibited by Apatinib. Cancer Lett ,2016,373(2): 193-202.

［11］ Lin C, Wang S, Xie W, et al. Apatinib inhibits cellular invasion and migration by fusion kinase KIF5B-RET via suppressing RET/Src signaling pathway. Oncotarget ,2016,7(37): 59236-59244.

［12］ Mi YJ, Liang YJ, Huang HB, et al. Apatinib (YN968D1) reverses multidrug resistance by inhibiting the efflux function of multiple ATP-binding cassette transporters. Cancer Res ,2010, 70(20):7981-7991.

［13］ Subhash VV, Tan SH, Yeo MS, et al. ATM Expression Predicts Veliparib and Irinotecan Sensitivity in Gastric Cancer by Mediating P53-Independent Regulation of Cell Cycle and Apoptosis. Mol Cancer Ther ,2016,15(12): 3087-3096.

［14］ Takahashi T, Ueno H, Shibuya M. VEGF activates protein kinase C-dependent, but Ras-independent Raf-MEK-MAP kinase pathway for DNA synthesis in primary endothelial cells.Oncogene ,1999,18(13): 2221-2230.