分離膜在轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)中的應(yīng)用

曹占平 ，宋曉緒 ，范云雙 ，，王尚尚 ，蘇建東 ，劉恩華

（1.天津工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300387；2.天津工業(yè)大學(xué) 分離膜與膜過程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/分離膜科學(xué)與技術(shù)國家級國際合作研究中心，天津 300387；3.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308）

轉(zhuǎn)移因子（transfer factor，TF）作為一種特定的淋巴細(xì)胞因子參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細(xì)胞活性、增強(qiáng)機(jī)體特異性和非特異性免疫功能等作用.目前，常見的有牛轉(zhuǎn)移因子、豬轉(zhuǎn)移因子、雞轉(zhuǎn)移因子，并且轉(zhuǎn)移因子逐漸應(yīng)用于動物疾病的防治上，如對牛[1]、豬[2]、雞[3]和犬[4]均有明顯的效果；雞轉(zhuǎn)移因子在畜禽病的治療方面也有不少報(bào)道[5-7].

目前，制備TF的原料大部分使用豬、雞等動物的脾臟，經(jīng)典的TF生產(chǎn)方法是Laurence法（透析法），此方法操作簡單，但生產(chǎn)周期長，成本高，不適合規(guī)?；a(chǎn)[8-10].文獻(xiàn)[11]報(bào)道，兩步 pH調(diào)節(jié)+超濾工藝，適于轉(zhuǎn)移因子的工業(yè)化生產(chǎn).但是脾臟經(jīng)勻漿、凍融后呈稀薄的糊狀，如何去除細(xì)胞殘?jiān)浅瑸V的關(guān)鍵.而管式微濾膜組件的寬流道具有良好的流動狀態(tài)，不易堵塞，膜管可以拆裝和重復(fù)使用，適合脾臟勻漿液生產(chǎn)轉(zhuǎn)移因子的超濾工藝的預(yù)處理[12-14].

本次實(shí)驗(yàn)將新鮮豬脾臟經(jīng)去血、去脂和去筋膜等雜質(zhì)后再進(jìn)行初絞、精絞、滅活、凍融、離心，取上清液；用管式微濾膜進(jìn)行過濾，去除上清液中的懸浮物、膠體等較大顆粒的雜質(zhì)，得到澄清透明的料液；然后用截留分子質(zhì)量為6 ku的超濾膜進(jìn)行進(jìn)一步純化，去除料液中大分子蛋白等雜質(zhì)，保留小分子的有效成分，即制得畜禽用轉(zhuǎn)移因子半成品，再經(jīng)除菌、檢驗(yàn)、包裝即得產(chǎn)品.本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃谧畲笙薅缺３之a(chǎn)物活性、提高得率，同時(shí)適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)需求的基礎(chǔ)上，探索出一條新的生產(chǎn)工藝流程.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

豬脾臟均質(zhì)液：將新鮮豬脾臟經(jīng)去血、去脂和去筋膜等雜質(zhì)后再進(jìn)行初絞、精絞、滅活、反復(fù)凍融、離心分離取上清液.

管式微濾設(shè)備：由天津海普爾科技股份有限公司提供，管式微濾膜選用孔徑為0.03 μm、外徑為12mm、內(nèi)徑10 mm、長2 m的7根管式微濾膜構(gòu)成的管式膜組件，膜組件過濾面積約0.5 m2.

中空纖維超濾設(shè)備：由天津膜天膜科技股份有限公司提供，超濾膜截留分子質(zhì)量為6 ku，膜組件的過濾面積為2 m2.

其他材料和儀器：分析純氫氧化鈉、潔凈塑料桶（100 L、75 L、25 L、5 L）、量杯（1 000 mL、500 mL、250 mL）、秒表等，均為市售.

1.2 轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)工藝流程

TF分離膜生產(chǎn)工藝流程如圖1所示.

圖1 TF分離膜生產(chǎn)工藝流程Fig.1 Flow chart of TF production process bymembrane technology

分離膜生產(chǎn)工藝主要處理設(shè)備包括2部分，即管式微濾設(shè)備和中空纖維超濾設(shè)備.管式微濾設(shè)備作用是去除原料物料中的懸浮物、膠體等較大顆粒的雜質(zhì)，得到澄清透明的料液；經(jīng)過管式微濾膜設(shè)備生產(chǎn)的澄清料液再經(jīng)過中空纖維超濾處理純化，去除料液中大分子蛋白等雜質(zhì)，保留6 ku分子質(zhì)量下的小分子物質(zhì)有效成分，即制得半成品.

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

1.3.1 管式膜微濾實(shí)驗(yàn)

按實(shí)驗(yàn)要求安裝管式膜組件，純水循環(huán)沖洗3次，測定在0.05 MPa壓力下的純水透水量；用純水將豬脾臟均質(zhì)液稀釋，開泵，選擇低進(jìn)膜流量和低膜壓力下運(yùn)行，當(dāng)均質(zhì)液進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)，控制操作壓力在0.05 MPa左右，收集微濾透過液，記錄每升透過液的所用時(shí)間，每隔15 min記錄脾臟均質(zhì)液和微濾透過液的溫度；透過液收集結(jié)束后，處理脾臟均質(zhì)液的濃縮循環(huán)液；微濾系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)清洗，記錄清洗后的純水透過量.

1.3.2 超濾組件超濾實(shí)驗(yàn)

安裝超濾裝置，純水循環(huán)沖洗3次，測定在0.05 MPa壓力下的純水透水量；將管式微濾設(shè)備收集到的微濾透過液作為超濾系統(tǒng)的待過濾料液，混勻，開泵，在0.05 MPa壓力下收集超濾透過液，記錄收集1 L濾液所需時(shí)間.超濾透過液收集結(jié)束后，超濾透過液即作為TF半成品；超濾系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)清洗，記錄清洗后的純水透過量.超濾透過液混勻，留樣測定多肽、核糖含量及TF活性.

1.3.3 膜清洗工藝

管式膜組件和超濾裝置清洗步驟大體相同，視實(shí)際情況具體操作.先向微濾原水罐中加入純水，加熱到30～40℃，沖洗管式膜及管路至出水基本無色.排盡裝置中的水，加入氫氧化鈉溶液進(jìn)行堿洗，系統(tǒng)循環(huán)20～30 min；再次加入純水進(jìn)行水洗，沖洗到出水口與進(jìn)水口pH值接近時(shí)，繼續(xù)加入純水沖洗，直至濃縮口與進(jìn)水口pH值接近；膜組件經(jīng)過純化水沖洗完畢后，再注入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%甲醛溶液，循環(huán)15～30 min，將膜組件用0.5%的甲醛保存起來，再次使用前用純化水洗凈.

膜過濾結(jié)束后，以清洗后純水透過速率為考察指標(biāo)，比較管式微濾膜和超濾膜的恢復(fù)情況.

1.3.4 多肽及核糖含量測定

采用Lowery（福林酚）法對超濾透過液的多肽含量進(jìn)行檢測，用二羥基甲苯法測定超濾透過液核糖含量，用E玫瑰花環(huán)法測定超濾透過液活性.

2 結(jié)果與討論

2.1 管式微濾實(shí)驗(yàn)中脾臟均質(zhì)液稀釋方法的確定

管式膜組件的寬流道具有良好的流動狀態(tài)，不易堵塞，膜管可以拆裝和重復(fù)使用，適合具有一定粘度的高固含量的液體物料過濾除雜和提純.本工藝選用管式微濾膜裝置對反復(fù)凍融3次的脾臟均質(zhì)液進(jìn)行第一次過濾，去除脾臟均質(zhì)液的細(xì)胞碎片以及膠體物質(zhì)等，對料液進(jìn)行澄清；由于均質(zhì)液固含量高、粘稠，不適于管式膜直接過濾，因此需要對均質(zhì)液進(jìn)行稀釋.

實(shí)驗(yàn)中用純化水稀釋豬脾臟均質(zhì)液有2種稀釋方法.方法①：按照體積比為1∶2的比例用純水直接把25 L均質(zhì)液稀釋至75 L；方法②：按照體積比為1∶1的比例用純水把25 L均質(zhì)液稀釋至50 L，在過濾過程中，隨著微濾透過液被收集10 L后，向均質(zhì)液中不間斷加入純水25 L，加入純水速率與過濾速率基本平衡，直至收集透過液50 L過濾操作結(jié)束.本實(shí)驗(yàn)研究稀釋方法對微濾和超濾的工作效率、微濾操作溫度、微濾和超濾的透過速率的影響以及半成品中多肽、核糖以及活性的影響，從而確定微濾實(shí)驗(yàn)中均質(zhì)液的稀釋方法.

2.1.1 微濾、超濾裝置透過效率

微濾、超濾裝置透過效率結(jié)果如表1和表2所示.

表1 2種稀釋方法的微濾過濾效率Tab.1 MF efficiency of two kinds of dilution methods

表2 2種稀釋方法的超濾過濾效率Tab.2 Ultrafiltration efficiency of two kinds of dilution methods

由表1和表2可見，同樣的待過濾料液體積75 L，透過體積50 L，采用稀釋方法①微濾耗時(shí)3.72 h，超濾耗時(shí)0.75 h，合計(jì)4.47 h.而方法②微濾耗時(shí)2.18 h，超濾耗時(shí)0.86 h，合計(jì)3.04 h；顯然方法②過濾效率更高.因?yàn)殡S著膜過濾的進(jìn)行，包含轉(zhuǎn)移因子在內(nèi)的小分子物質(zhì)透過微濾膜被收集，均質(zhì)液原液不斷被濃縮，因此在管式膜待過濾物中不斷補(bǔ)加純化水，可以起到稀釋、沖洗、提高過濾效果的作用.管式膜組件（0.5 m2）每 1 h透過量可達(dá)約 20 L，超濾膜組件（2 m2）每1 h透過量可達(dá)約50 L以上，過濾效率高、耗時(shí)短，可以明顯縮短生產(chǎn)周期，更適合規(guī)?；a(chǎn).

2.1.2 2種稀釋方法中溶液溫度變化情況

TF是一類具有多種生物學(xué)活性的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，人們普遍認(rèn)為TF在低溫下維持其生物活性，在高溫下活性會短時(shí)間內(nèi)消失[15]，因此為了保證TF的活性，需要控制膜過濾過程中的溫度.如果溫度超過37℃，應(yīng)盡快停止操作，對均質(zhì)液進(jìn)行降溫處理.微濾設(shè)備由于錯(cuò)流流速高，液體循環(huán)量大，所以溫度變化比較大，如表3所示.而超濾設(shè)備在運(yùn)行期間溫度變化較小，基本恒定在13～16℃.

表3 2種稀釋方法的微濾過濾過程中均質(zhì)液溫度變化情況Tab.3 Changes of solution temperaturein tube MF process by two dilution methods

由表3可見，顯示稀釋方法②在整個(gè)連續(xù)的過濾過程中，稀釋均質(zhì)液的溫度在18～35.5℃.而稀釋方法①在連續(xù)工作過程中，稀釋液的溫度升高較快，在運(yùn)行后期達(dá)到38℃，為了保證膜在正常溫度下工作，需要對稀釋液進(jìn)行桶外冰水降溫，以防稀釋液溫度繼續(xù)升高，也保證生產(chǎn)的連續(xù)性.方法①的溫度上升較快與過濾體積有關(guān).由于微濾膜的錯(cuò)流過濾，料液不斷循環(huán)使料液溫度不斷上升，而①組實(shí)驗(yàn)的料液體積不斷減少，溫度上升速度也較快.而方法②在管式膜待過濾物中不斷補(bǔ)加溫度較低純化水（15℃），可以維持料液溫度處于適宜范圍.

2.1.3 2種稀釋方法對管式微濾液透過速率的影響

以累計(jì)收集的透過液體積為橫坐標(biāo)，每升微濾透過液的透過速率為縱坐標(biāo)，繪制兩者的關(guān)系如圖2所示.

圖2 2種不同稀釋方法對微濾液透過速率的影響Fig.2 Effects of dilution methods on MF permeate rate

由圖2可見，方法①組在整個(gè)過程中膜透過量逐步降低，主要是由于料液濃度及黏度不斷增大，膜表面的形成凝膠層以及膜孔阻塞造成的.而微濾②組在整個(gè)過程中膜通量相對穩(wěn)定，剛開始膜通量較低，是由于相對于①組固含量高，在收集10 L透過液后，開始加入純水，透過速率與加純水速度基本恒定，待過濾料液的濃度和溫度相對恒定，因此過濾速率也比較穩(wěn)定.而且由于料液小分子量物質(zhì)被析出，粘度也相對在降低，微濾透過速率在前期甚至略有上升趨勢.在過濾后期，料液固含量增加，膜污染造成透過速率下降.

2.1.4 2種稀釋方法對超濾透過速率的影響

以累計(jì)收集的透過液體積為橫坐標(biāo)，每升超濾透過液的透過速率為縱坐標(biāo)，繪制兩者的關(guān)系如圖3所示.

圖3 2種不同稀釋方法對超濾液透過速率的影響Fig.3 Effects of dilution methods on UF permeaterate

由圖3可見，微濾透過液采用超濾設(shè)備進(jìn)行轉(zhuǎn)移因子進(jìn)一步提純，50 L料液在45 min內(nèi)即可完成，操作溫度穩(wěn)定在13～16℃，超濾透過液可達(dá)48 L，回收率達(dá)到96%.第1次超濾過程中，透過率下降明顯，而第2次超濾過程中，全程的透過速率變化較小，可能由于按照稀釋方法①收集到的微濾透過液濃度較高造成的，這也與該組生產(chǎn)的TF原液的多肽和核糖含量較高的結(jié)果一致.

2.1.5 2種稀釋方法收集的超濾液活性成分分析

將2種稀釋方法收集的超濾液進(jìn)行活性成分分析，結(jié)果如表4所示.

表4 均質(zhì)液2種不同稀釋方法的比較Tab.4 Comparison of two dilution methods for homogenate

由表4可知，稀釋方法①的多肽和核糖成分濃度也略高，由于濾過時(shí)間較長的原因，而活性略低.在TF半成品中，要求多肽含量每1 mL應(yīng)不小于1.5 mg，核糖含量每1 mL應(yīng)不小于50 μg.因此2種稀釋方法均能達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn).

2.2 反復(fù)凍融次數(shù)對管式微濾和超濾透過速率的影響

勻漿液反復(fù)凍融次數(shù)對產(chǎn)品的收率和質(zhì)量有很大的影響.反復(fù)凍融促使細(xì)胞完全破碎，使TF充分釋放出來，從而提高產(chǎn)品的收率.勻漿液凍融次數(shù)越多，TF溶液中多肽的濃度就越高.但凍融次數(shù)并非越多越好，凍融次數(shù)越多，核糖降解的越多，其產(chǎn)品中核糖與多肽的比值就越低.另外，勻漿液反復(fù)凍融次數(shù)與管式微濾和超濾的過濾效率也有關(guān).

對勻漿液反復(fù)凍融3次與反復(fù)凍融8次的管式微濾透過速率的變化進(jìn)行比較，如圖4所示.

圖4 不同凍融次數(shù)對微濾液透過液速率的影響Fig.4 Effect of different freezing and thawing times on microfiltration rate

由圖4可見，勻漿液凍融8次的微濾實(shí)驗(yàn)的透過速率較凍融3次明顯降低.采用同樣的均質(zhì)液稀釋方法②，凍融8次工藝微濾操作需要5.22 h，而凍融3次微濾需要2.18 h.凍融次數(shù)增多，脾細(xì)胞破碎率提高，細(xì)胞內(nèi)肽類等有效成份溶出率提高，但是細(xì)胞殘?jiān)槠恳苍龆啵@些細(xì)胞殘?jiān)槠觿×宋V膜濃差極化的阻力造成透過速率下降.凍融8次的微濾透過液50 L用超濾設(shè)備提純，可回收48 L超濾透過液，而且超濾操作在42 min內(nèi)完成.超濾設(shè)備的過濾速率如圖5所示.

圖5 不同凍融次數(shù)對超濾液透過速率的影響Fig.5 UF permeate rate in different freezing and thawing times for homogenate

由圖5可知，凍融8次的超濾速率比凍融3次的有所提升，這主要是由于本次試驗(yàn)操作溫度為25℃，而凍融3次的超濾過濾溫度為13～16℃.

不同凍融次數(shù)工藝的比較如表5所示.

從表5可以看出，在規(guī)模化生產(chǎn)中凍融次數(shù)要根據(jù)產(chǎn)品活性成分含量和生產(chǎn)效率綜合確定.反復(fù)凍融3次比較合適，既能滿足產(chǎn)品質(zhì)量要求，又能提高生產(chǎn)效率.

表5 不同凍融次數(shù)工藝的比較Tab.5 Comparison of different freeze-thaw times processes

2.3 管式微濾設(shè)備和超濾設(shè)備的清洗恢復(fù)情況

分別以清洗方法和清洗次數(shù)為橫坐標(biāo)，以純水透過速率為縱坐標(biāo)，繪制微濾設(shè)備、超濾設(shè)備純水透過速率變化圖如圖6和圖7所示.

圖6 清洗方法對微濾膜純水透過速率的影響Fig.6 Effect of cleaning method on pure water transmission rate of MF

圖7 清洗次數(shù)對膜純水透過速率的影響Fig.7 Effect of cleaning method on membrane pure water transmission rate

由圖6和圖7可知，每一批均質(zhì)液經(jīng)管式微濾膜和超濾設(shè)備過濾結(jié)束后，微濾膜和超濾膜都要盡快進(jìn)行清洗.微濾膜和超濾膜清洗工藝基本相同.清洗方法為純水沖洗和氫氧化鈉溶液浸泡或低流量循環(huán)清洗.清洗后的純水透過速率作為考察指標(biāo)比較管式微濾膜和超濾膜的恢復(fù)情況.管式微濾膜在第1次使用后，使用0.1%氫氧化鈉清洗后，膜的純水透過速率分別恢復(fù)到新膜的43.3%；而用1.0%氫氧化鈉清洗后，膜的純水透過速率分別恢復(fù)到新膜的46.3%，純水通量的變化是新膜第1次使用造成的膜的不可逆污染造成的.0.1%和1.0%氫氧化鈉在恢復(fù)膜透過速率的清洗濃度上，差異不明顯，低濃度堿液足以進(jìn)行膜的清洗.因此，在每次試驗(yàn)結(jié)束后，微濾和超濾膜都采用純水沖洗和0.1%氫氧化鈉溶液浸泡或低流量循環(huán)的清洗方式.圖7表示經(jīng)過6批次過濾后的微濾膜和超濾膜純水透過速率的恢復(fù)情況.第1次使用后，微濾膜純水透過速率陡降至新膜的43.3%，以后5次使用并清洗后的純水透過速率下降很緩慢，基本都能恢復(fù)到第2次的90%左右.因此，恰當(dāng)?shù)那逑捶绞交灸鼙ＷC分離膜工藝在TF生產(chǎn)中的連續(xù)性.

2.4 分離膜工藝與傳統(tǒng)工藝比較

采用分離膜工藝運(yùn)行3批，與傳統(tǒng)工藝對比，測定結(jié)果如表6所示.

表6 分離膜工藝與傳統(tǒng)工藝的比較Tab.6 Membrane technology compared with traditional process

由表6可知，傳統(tǒng)工藝透析法（Laurence法），即直接將離心上清液置于透析袋中，于4℃用等體積的注射用水透析24 h，換注射用水再透析24 h，收集合并透析液.通過對傳統(tǒng)工藝與分離膜工藝對比可發(fā)現(xiàn)采用膜過濾技術(shù)生產(chǎn)TF，縮短了原液生產(chǎn)周期，TF的收率、含量及活性等都有明顯提高，可以作為TF規(guī)?；a(chǎn)的一種方法.

3 結(jié) 論

（1）脾臟均質(zhì)液采用純水1∶1（體積比）稀釋，在過濾過程中不斷添加純水以降低操作溫度、并提高過濾效率.微濾和超濾操作可以在約3 h完成，操作溫度始終低于37℃，更適宜TF的生產(chǎn)，超濾透過液中多肽、核糖的含量也符合半成品的要求.

（2）在大規(guī)模生產(chǎn)中凍融次數(shù)要根據(jù)產(chǎn)品活性成分含量和生產(chǎn)效率綜合確定.反復(fù)凍融3次比較合適，更適宜分離膜工藝操作.

（3）每一批均質(zhì)液經(jīng)管式微濾膜和超濾設(shè)備過濾結(jié)束后，微濾膜和超濾膜都要盡快進(jìn)行清洗.6批次過濾后的膜通量恢復(fù)情況良好，可用于連續(xù)生產(chǎn).

（4）采用膜過濾技術(shù)生產(chǎn)TF，縮短了原液生產(chǎn)周期，TF的收率、含量及活性等都有明顯提高，可以作為TF規(guī)?；a(chǎn)的一種方式.

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