鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片活性氧代謝及光合光響應(yīng)特性的影響

張曉曉，陳雙雙，鄭 婷，酈 楓，劉 鵬

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/浙江省野生動(dòng)物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江金華 321004)

鋁是土壤中最主要的金屬元素，通常以難溶性鋁硅酸鹽或氧化鋁等穩(wěn)定的絡(luò)合物形式存在，對(duì)植物無(wú)毒害作用，但當(dāng)土壤pH值<5時(shí)，難溶性鋁會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄凿X離子，并隨著環(huán)境污染的加劇呈指數(shù)型增長(zhǎng)。近幾年南方紅壤區(qū)土壤酸化面積加大，酸化程度日趨嚴(yán)重，造成鋁毒害現(xiàn)象加重，導(dǎo)致該區(qū)耕地的生產(chǎn)力和質(zhì)量都逐步下降[1]。有研究表明，當(dāng)土壤交換性鋁含量過(guò)多時(shí)，植物會(huì)表現(xiàn)出明顯的鋁毒害癥狀，主要為根尖結(jié)構(gòu)被破壞以及根系的伸長(zhǎng)和吸收功能被抑制，從而影響作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。

虎舌紅(ArdisiamamillataHance)屬紫金?？?Myrsinaceae)常綠小灌木，具有匍匐的木質(zhì)根狀莖，葉片紅潤(rùn)橢圓形，其紅紫色茸毛可折射出七彩佛光，故又稱佛光紅[2]；株形優(yōu)美，葉果皆可以觀賞，果實(shí)成熟期較長(zhǎng)，周年不落，老果新果同掛一株，色澤紅而發(fā)亮，甚為美觀。適應(yīng)性強(qiáng)的虎舌紅既可在各地居室中盆栽，也可在園林中作耐陰地被植物，且易栽培管理。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)虎舌紅的研究主要針對(duì)化學(xué)成分的種類[3]、功效[4-5]及繁殖技術(shù)[6]等方面，而對(duì)虎舌紅逆境脅迫下的探究較少，僅少數(shù)學(xué)者探索紫金?？谱辖鹋Ardisiajaponica(Thunb) Blume][7]和堇葉紫金牛(Ardisiaviolacea)[8]對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)，而對(duì)價(jià)值高的虎舌紅在紅壤環(huán)境下的抗鋁性研究尚未見報(bào)道。有研究顯示，一定濃度A13+處理可抑制大豆 [Glycinemax(Linn.) Merr.][9-10]根系的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其脂質(zhì)過(guò)氧化[11]等；此外，較高濃度的鋁脅迫也可導(dǎo)致水稻(OryzasativaL.)出現(xiàn)枯萎黃化等明顯受傷癥狀[12]。因此，筆者以虎舌紅為試驗(yàn)材料，通過(guò)溶液培養(yǎng)法研究鋁脅迫下其葉片活性氧的代謝情況和光合光響應(yīng)特性，探討其對(duì)鋁毒害響應(yīng)的生理機(jī)制，揭示其在鋁脅迫下的抗逆性大小，為紫金?？浦参锘⑸嗉t的抗鋁性和緩解土壤鋁毒害的研究提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)材料為生長(zhǎng)一致的盆栽虎舌紅(二年生扦插苗)，野生扦插苗采于江西省大余縣吉村鎮(zhèn)山區(qū)。盆栽用塑料花盆上、下口的平均直徑分別為28、15 cm，高度為20 cm，每盆定植苗木1株。1盆土壤質(zhì)量約3 kg，盆底放置2層塑料紙。在光照培養(yǎng)室內(nèi)土培適應(yīng)1個(gè)月后，先將其轉(zhuǎn)入Hoagland’s半完全營(yíng)養(yǎng)液中適應(yīng)15 d，然后于完全營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培育和脅迫處理。試驗(yàn)設(shè)計(jì)5個(gè)鋁離子(Al3+)濃度處理，分別為 0 μmol/L(CK)、200 μmol/L(T1)、500 μmol/L(T2)、1 000 μmol/L(T3)和2 000 μmol/L(T4)，各處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。處理期間，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，在脅迫處理7、14、21 d 08：00—12：00 取頂端的第3～4張成熟葉片，測(cè)定其相關(guān)生理指標(biāo)。

1.2 測(cè)定方法

采用愈創(chuàng)木酚法[13]測(cè)定葉片過(guò)氧化物酶(POD)活性，氮藍(lán)四唑(NBT)法[12]測(cè)定葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性，紫外吸收法[13]測(cè)定葉片過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，硫代巴比妥酸法[13]測(cè)定丙二醛(MDA)含量，PAM-210葉綠素測(cè)定儀測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)[13]，丙酮研磨法[13]測(cè)定葉綠素a、b含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，以單因素方差分析法和Duncan’s法進(jìn)行顯著性差異分析，用Excel 2013、Origin 9.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片SOD、POD、CAT活性的影響

2.1.1 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片SOD的影響 超氧化物歧化酶(SOD)廣泛存在于生物體內(nèi)，專一性地清除生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有毒害作用的超氧陰離子自由基。從圖1可以看出，Al3+脅迫期間，隨脅迫濃度的增大，虎舌紅葉片的SOD活性先升高后降低，其中T2處理時(shí)達(dá)到最大值。低濃度T2處理組SOD活性與CK差異顯著，且脅迫14、21 d時(shí)任一處理組SOD活性均高于CK，說(shuō)明在Al3+處理下虎舌紅葉片通過(guò)迅速增加SOD活性來(lái)保護(hù)細(xì)胞，在防止脅迫條件下活性氧含量增加導(dǎo)致的損害中起著重要作用。同時(shí)，Al3+處理7、14、21 d時(shí)，低濃度T1下SOD活性增幅分別為7.34%、17.16%、32.59%，高濃度T4下增幅分別為3.14%、9.78%、9.43%，可見低濃度對(duì)SOD活性的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于高濃度。

在脅迫7、14、21 d時(shí)，處理組虎舌紅葉片SOD活性相比CK的最大增幅依次為37.07%、57.11%、74.43%，表明在脅迫初期，虎舌紅葉片的SOD活性被小幅度誘導(dǎo)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)其被誘導(dǎo)的幅度逐漸增加，說(shuō)明脅迫后期虎舌紅表現(xiàn)出了對(duì)Al3+脅迫的適應(yīng)性。

2.1.2 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片POD的影響 過(guò)氧化物酶(POD)是一類性質(zhì)比較穩(wěn)定的氧化還原酶類，可催化由過(guò)氧化氫(H2O2)參與的各種還原劑的氧化反應(yīng)，在植物對(duì)環(huán)境的應(yīng)答方面起著重要的調(diào)節(jié)和保護(hù)作用。由圖1可知，除T4處理外，虎舌紅葉片的POD活性與脅迫濃度呈正相關(guān)關(guān)系，在低濃度T1處理下，POD活性保持在低水平狀態(tài)，最大增幅為54.83%；而在中濃度T3與高濃度T4處理下，處理組的POD活性與CK存在顯著差異，最小增幅為100.85%，表明較高的Al3+濃度更能激發(fā)虎舌紅葉片POD活性的上升以維持虎舌紅葉片活性氧代謝的平衡。

鋁脅迫7、14、21 d時(shí)，虎舌紅葉片的POD活性分別比對(duì)照上升了27.37%～218.71%、21.81%～239.87%、54.83%～420.48%，說(shuō)明虎舌紅葉片的POD活性與脅迫時(shí)間整體上呈正相關(guān)關(guān)系，與脅迫濃度的影響情況基本一致。

2.1.3 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片CAT的影響 植物代謝產(chǎn)物H2O2對(duì)植物細(xì)胞具有損傷作用，而過(guò)氧化氫酶(CAT)是清除H2O2的主要酶類，可保護(hù)植物細(xì)胞。目前研究已證實(shí)增強(qiáng)植物抗逆性的途徑之一是提高植物體內(nèi)抗氧化酶類活性及增強(qiáng)抗氧化代謝的水平。圖1表明，在鋁脅迫條件下，處理組虎舌紅葉片CAT活性在3個(gè)處理期(7、14、21 d)均低于CK，分別為CK的33.88%～95.14%、49.91%～79.78%、59.27%～73.64%，且同一時(shí)期內(nèi)隨脅迫濃度的增大其活性總體呈降低的趨勢(shì)。同時(shí)還可以看出，T1、T2、T3處理下虎舌紅葉片CAT活性的最低值均出現(xiàn)在脅迫21 d，而T4組CAT活性最低值在脅迫7 d，表明中低濃度(T1、T2、T3)處理與高濃度(T4)處理下的虎舌紅對(duì)脅迫時(shí)間的反應(yīng)存在一定差異。

SOD把超氧化物歧化為H2O2后，在一定強(qiáng)度的環(huán)境脅迫下CAT和POD有互補(bǔ)的作用，脅迫期間POD活性變化趨勢(shì)與CAT相反，因此本試驗(yàn)中虎舌紅葉片CAT活性的降低可能有利于POD活性的增加與其功能的發(fā)揮。

2.2 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片丙二醛含量的影響

植物器官在逆境條件下，通常會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化，而MDA可反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度以及植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱。由圖2可知，鋁脅迫條件下，虎舌紅葉片內(nèi)的MDA含量增加，且具有濃度效應(yīng)，即隨脅迫濃度的增加，虎舌紅葉片內(nèi)的MDA含量增加得越明顯，3個(gè)處理期的平均脅迫濃度從T1增加到T4時(shí)，MDA含量從對(duì)照的112.10%上升為對(duì)照的216.86%；且當(dāng)濃度為T2時(shí)MDA含量開始與對(duì)照組產(chǎn)生明顯差異，不同時(shí)期(處理14、21 d)T2組的MDA含量分別為對(duì)照的143.44%、153.44%，反映出脅迫濃度越大，虎舌紅葉片的膜脂過(guò)氧化越嚴(yán)重。當(dāng)處理時(shí)間由7 d延長(zhǎng)到21 d時(shí)，MDA含量最大增幅由132.08%降到了95.70%，表明脅迫時(shí)間對(duì)葉片MDA含量的影響與濃度不一致。

2.3 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片葉綠素?zé)晒獾挠绊?/h3>

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)是快速檢測(cè)植物光合機(jī)構(gòu)損傷程度的靈敏探針，可反映植物光合生理特性與逆境脅迫的關(guān)系。由表1可知，脅迫7、14 d時(shí)，F(xiàn)o均在T2處理時(shí)達(dá)到最大值，較對(duì)照分別增加54.83%、57.00%，而當(dāng)脅迫21 d時(shí)，T3濃度時(shí)Fo被顯著抑制27.61%，這說(shuō)明虎舌紅葉片在較高鋁濃度處理下光合效率會(huì)受到輕微損害。T2、T3、T4處理組的Fm在脅迫7 d時(shí)有顯著變化，而當(dāng)處理14、21 d時(shí)，低鋁處理下Fm明顯增加，高鋁濃度下表現(xiàn)出被抑制。ETR為電子傳遞速率，處理7、14 d時(shí)，ETR均在T2被顯著抑制，最高被抑制了43.95%，而至脅迫21 d時(shí)各濃度處理下變化較小。 高濃度下Yield在前2個(gè)處理時(shí)間均無(wú)顯著變化，低鋁濃度對(duì)其有微小促進(jìn)作用。光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)反映光抑制(Photosystem II)天線色數(shù)吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)的份額。脅迫7 d時(shí)，在T1處理下增大14.84%，而在T2處理下減小，脅迫21 d時(shí)，高濃度有顯著變化。qN為非光化學(xué)猝滅系數(shù)，在脅迫第1周期內(nèi)整體上隨鋁濃度的增加呈先增大后減小再增大的趨勢(shì)，表明低鋁濃度下虎舌紅葉片可通過(guò)增加qN來(lái)緩解逆境脅迫帶來(lái)的傷害。

表1 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

注：Fo表示最小熒光；Fm表示最大熒光產(chǎn)量；ETR表示表觀電子傳遞速率；Yield表示熒光量子效率；qP表示光化學(xué)淬滅系數(shù)；qN表示非光化學(xué)淬滅參數(shù)；同欄同列數(shù)據(jù)后的不同小寫寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片葉綠素a、b含量的影響

葉綠素廣泛存在于綠色植物體內(nèi)，具有著色和營(yíng)養(yǎng)雙重功效，是植物光合色素中最重要的一類色素，而其中以葉綠素a、葉綠素b尤為重要。在鋁脅迫下，虎舌紅葉片葉綠素含量不僅直接關(guān)系著虎舌紅光合同化過(guò)程，而且是衡量其抗逆性的重要指標(biāo)之一。從圖3可以看出，Al3+處理下虎舌紅葉片的葉綠素a含量、葉綠素b含量以及葉綠素a+b含量隨脅迫濃度的增加均呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，在T2處理下達(dá)到最大值。同時(shí)，在T2處理下葉綠素a的含量在脅迫7、14、21 d 后的增幅分別為120.03%、48.81%、54.32%，葉綠素b含量的增幅分別為95.90%、50.91%、49.65%，葉綠素a+b含量的增幅分別為114.58%、49.41%、52.87%，表明低濃度且短時(shí)間的鋁脅迫有利于虎舌紅葉片葉綠素的積累。

虎舌紅葉片葉綠素b含量整體上隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，而葉綠素a與葉綠素a+b含量整體上隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，說(shuō)明輕度脅迫能誘導(dǎo)虎舌紅葉片葉綠素含量的上升，且最適誘導(dǎo)濃度為500 μmol/L，而重度脅迫則對(duì)葉綠素含量產(chǎn)生抑制作用，可反映出重度脅迫下虎舌紅葉片活性氧代謝減慢。

3 討論與結(jié)論

鋁是地殼中最豐富的金屬元素，當(dāng)其表現(xiàn)為細(xì)胞毒性形式時(shí)，可通過(guò)作用在根尖區(qū)而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)抑制。鋁的毒性作用機(jī)制可能是因?yàn)榧?xì)胞骨架失真、胼胝質(zhì)堆積對(duì)質(zhì)膜表面電荷的干擾，從而引起膜的脂質(zhì)過(guò)氧化[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在鋁脅迫下虎舌紅會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激、膜脂過(guò)氧化以及光合速率下降等現(xiàn)象，但抗鋁響應(yīng)程度存在一定的差異。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與CK相比，中度鋁脅迫能誘導(dǎo)虎舌紅SOD、POD活性上升，但高濃度鋁脅迫下僅CAT活性被抑制，這可能是由于鋁脅迫濃度超過(guò)其耐受度[15]所致。Chen等指出，金屬離子通過(guò)損害SOD等酶引起氧化脅迫[16]，符合高鋁脅迫下抗氧化酶活性被顯著抑制的現(xiàn)象；Brej報(bào)道顯示，冰草[Agropyroncristatum(L.) Gaertn.(Gramineae.)]葉片中的CAT活性在重金屬脅迫下顯著上升[17]，而本試驗(yàn)說(shuō)明虎舌紅CAT活性在不同脅迫濃度下均被抑制，這表明CAT可能不是其抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵酶。逆境下植物體內(nèi)MDA含量會(huì)增加，含量越高表示受傷害的程度越大。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度的鋁使虎舌紅葉片MDA含量升高，說(shuō)明鋁脅迫作用可導(dǎo)致虎舌紅葉片中活性氧等的大量產(chǎn)生，引發(fā)膜質(zhì)過(guò)氧化，這與Ylmaz等金屬脅迫下的研究結(jié)果[18-21]一致。

光合作用是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過(guò)程，在特定條件下所測(cè)得的光合能力可作為評(píng)估植物自身狀態(tài)的重要生理指標(biāo)，而葉片的光合速率與植物的自身因素(葉綠素含量、葉片厚度等)密切相關(guān)，同時(shí)又受到光照強(qiáng)度、氣溫、空氣相對(duì)濕度等外界因素的限制，因此逆境鋁脅迫對(duì)光合作用的影響過(guò)程是極其復(fù)雜的。本試驗(yàn)對(duì)虎舌紅葉片的葉綠素含量以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測(cè)定，從結(jié)果來(lái)看，一方面可知高鋁濃度會(huì)抑制虎舌紅的光合作用，但隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)效果減弱；而另一方面說(shuō)明，前2個(gè)周期低鋁濃度(T2、T3)下虎舌紅可通過(guò)部分熒光參數(shù)Fo、Yield、qN以及葉綠素含量的增加緩解鋁毒作用，這與馬新明等輕度干旱脅迫下葉片光系統(tǒng)Ⅱ活性和光化學(xué)最大效率的增加結(jié)果[21]相一致。光合色素中的葉綠素在光合作用過(guò)程中起著接收和轉(zhuǎn)換能量的作用，能將光能轉(zhuǎn)換成化學(xué)能，其中葉綠素a分子執(zhí)行能量轉(zhuǎn)化，葉綠素b是光色素蛋白復(fù)合體的重要組成部分，其作用主要在于捕獲和傳遞光能，因此推測(cè)鋁脅迫可能通過(guò)抑制或減弱葉綠素對(duì)光能的吸收和轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)毒害作用，而植物可通過(guò)增加葉綠素含量來(lái)抵消低鋁脅迫對(duì)自身造成的損害，卻無(wú)法抵抗高鋁脅迫帶來(lái)的傷害。

綜上所述，鋁脅迫引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)活性氧等的過(guò)度積累及其所導(dǎo)致的膜脂過(guò)氧化對(duì)葉綠素a、葉綠素b合成的影響可能是脅迫傷害虎舌紅幼苗的主要原因，雖然較高濃度的Al3+對(duì)虎舌紅造成某種程度的損害，但低濃度的Al3+對(duì)虎舌紅的生長(zhǎng)沒有損傷，相反有適當(dāng)?shù)拇龠M(jìn)作用，因此虎舌紅具有較強(qiáng)的抗鋁性，并且可通過(guò)SOD活性、POD活性、葉綠素含量以及Fo、Yield、qN的增加來(lái)抵御鋁毒害，從而使自身得以生存和生長(zhǎng)，但虎舌紅只能在一定濃度范圍內(nèi)抵御鋁脅迫，因此對(duì)高濃度鋁脅迫要提前做好預(yù)防措施。

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