金針菇菌株遺傳多樣性的RAPD分析

李 紅，李 超，張 敏

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧沈陽 110161)

金針菇[Flammulinavelutipes(Fr.)Singer.]隸屬于真菌門擔(dān)子菌亞門層菌綱無隔擔(dān)子菌亞綱傘菌目口蘑科小火焰菌屬，因形似金針菜而得名。金針菇是古今中外著名的食用菌之一，金針菇蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類豐富，具有抗癌功能，經(jīng)常食用具有預(yù)防高血壓、治療肝病和胃潰瘍等功效。金針菇特別以富含賴氨酸而著稱，可以活化神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)智力發(fā)育，素有“增智菇”之美稱，是當(dāng)今市場(chǎng)上十分走俏的天然保健食品之一。隨著金針菇產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，金針菇新品種選育已成為食用菌育種研究的重要內(nèi)容之一，為此，開展金針菇菌株的遺傳多樣性分析及了解菌株間遺傳差異就具有重要意義。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱RAPD)標(biāo)記以基因組DNA為模板，以1個(gè)隨機(jī)的寡核苷酸序列(通常為10個(gè)堿基對(duì))作引物，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，用以檢測(cè)DNA序列的多態(tài)性。它具有程序簡(jiǎn)單、DNA用量少、隨機(jī)引物沒有嚴(yán)格的種屬界限、不須要事先知道基因組的任何分子信息就能快速檢測(cè)大量遺傳多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)。在食用菌領(lǐng)域常用于品種鑒定、遺傳關(guān)系分析、分子遺傳的構(gòu)建及基因定位等研究。Khush等用RAPD技術(shù)分析雙孢蘑菇的野生和栽培品種，在8個(gè)異核體中識(shí)別出7個(gè)不同的基因型。說明RAPD標(biāo)記在遺傳研究中的通用性和對(duì)菌株指紋識(shí)別的有效性[1]。Zhang等用RAPD標(biāo)記對(duì)15個(gè)香菇菌株行分析，其中13個(gè)菌株的DNA指紋各異，2個(gè)菌株譜帶一致，說明RAPD標(biāo)記可用于鑒別香菇菌種，并可用于香菇育種和菌種改良[2]。詹才新等以金針菇不同親本菌株及其雜交種為材料進(jìn)行RAPD分析后，認(rèn)為RAPD技術(shù)可鑒別出真?zhèn)坞s種[3]。Castle等曾以RFLP為標(biāo)記進(jìn)行雙孢蘑菇及大肥菇種內(nèi)和種間多態(tài)性研究。王翠等應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)滇西北地區(qū)冬蟲夏草、闊孢蟲草和蛹蟲草進(jìn)行遺傳分化研究，表明蟲草群體中存在著顯著的地區(qū)差異性[4]。本研究應(yīng)用RAPD-PCR分子標(biāo)記的方法對(duì)金針菇菌株遺傳多樣性進(jìn)行分析，以期為金針菇資源遺傳多樣性及遺傳育種親本的選配提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

各供試菌株的具體情況見表1。

表1 供試菌株

1.2 培養(yǎng)基

PDB綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯400 g，葡萄糖40 g，磷酸二氫鉀 6 g，硫酸鎂3 g，蛋白胨6 g，水2 000 mL，pH值自然。用于總DNA提取的菌絲培養(yǎng)。

1.3 試劑和儀器

RAPD-PCR反應(yīng)所用的TaqDNA Polymerase、dNTP、10×buffer、Mg2+購自北京鼎國(guó)昌盛公司，DNA marker(DL2000)、引物購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR儀為德國(guó)Biometra公司Thermocycler。

1.4 引物

各引物的具體情況見表2。

1.5 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年3月在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所進(jìn)行。

表2 22個(gè)引物序列

1.6 菌絲體培養(yǎng)

將活化的菌絲切下0.5 cm2菌塊，接種于PDB綜合培養(yǎng)基，23 ℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min。將培養(yǎng)好的菌液用無菌水洗滌2次，用無菌濾紙汲干菌絲體表面的水分，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 總DNA提取及檢測(cè)

采用改良的CTAB法提取基因組總DNA，0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。

1.8 引物篩選

引物篩選是進(jìn)行RAPD分析的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。用來篩選引物的模板采用4個(gè)具有典型性狀、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的材料，這樣篩出的引物才具有代表性，RAPD-PCR擴(kuò)增出的結(jié)果多態(tài)性較高且可能每份供試材料都能擴(kuò)增出豐富的多態(tài)性位點(diǎn)。

引物參照NY/T 1743—2009《食用菌菌種真實(shí)性鑒定 RAPD法》公布的22條引物序列，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.9 PCR反應(yīng)及電泳

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：模板DNA 200 ng/uL，dNTPs 200 μmol/L，引物0.4 μmol/L，TaqDNA聚合酶1.5 U，Mg2+2.5 mmol/L，10×buffer 2.5 μL，用ddH2O補(bǔ)至總體積25 μL。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，Tm退火1 min(退火溫度因不同引物而定)，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，用GelDoc-It型凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.10 數(shù)據(jù)處理

電泳結(jié)果采取0/1賦值記帶，將在瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)DNA片段的記為1，不出現(xiàn)的記為0，將統(tǒng)計(jì)形成的“0-1”數(shù)據(jù)表輸入DPSv6.55版數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件中，采用Jaccard聚類距離采用類平均法(UPGMA)進(jìn)行“0-1”聚類分析，并計(jì)算遺傳相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取

由圖1可以看出，每一樣品在電泳時(shí)均形成明顯的1條整齊帶，并且條帶比較亮，無彌散的熒光區(qū)出現(xiàn)，說明DNA樣品沒有降解。用CTAB法提取的DNA色澤近白色或無色。說明大多數(shù)酚類、多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)已被較徹底去除，純度比較高。

2.2 引物篩選

從22條引物中篩選出8條多態(tài)性豐富、譜帶清晰且重復(fù)性好的引物，分別為S15、S9、S6、S16、S18、S10、S4、S11，如圖2所示。

2.3 PCR反應(yīng)

利用篩選出來的8條引物對(duì)35個(gè)供試菌株進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出68條條帶(圖3、圖4、圖5)，其中多態(tài)性條帶為56條，多態(tài)位點(diǎn)率為82%。每條引物擴(kuò)增出約9條條帶，DNA片段大小為500～2 000 bp。

2.4 基于RAPD分析結(jié)果構(gòu)建樹狀圖

如圖6所示，35個(gè)菌株間的遺傳相異系數(shù)變化范圍在 0～0.71 之間。當(dāng)遺傳相異系數(shù)為0.60時(shí)，供試菌株被聚類成5個(gè)類群：第1類為BJ-11、BJ-12、BJ-13、日白金、韓金、珍玉8、411、白金2、千曲、白金48、913、白金1、恒生金、白金16、高產(chǎn)2、FV80、金851、白金3、金新美15、F21、純白68、特豐6、壽光5、金1312、韓金51、白金8、白金10，全部為白色品種；第2類為黃金5032、川金3、738；第3類為金玉22；第4類為406、黃金55；第5類為金19、金43。第2、第3、第4、第5類都是黃色金針菇品種，說明RAPD分析結(jié)果與菌株農(nóng)藝性狀結(jié)果趨同。

3 結(jié)論與討論

食用菌菌種、菌株的質(zhì)量好壞直接關(guān)系到食用菌產(chǎn)業(yè)能否良性發(fā)展。目前食用菌市場(chǎng)缺乏統(tǒng)一管理，菌種管理混亂，菌種退化、老化，品種混雜，同種異名、同名異種等問題嚴(yán)重。分子標(biāo)記技術(shù)為這一難題提供了快速、準(zhǔn)確的鑒定手段，可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地用于食用菌的菌種、菌株鑒定。

選擇雜交親本是食用菌雜交育種中最為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)之一。一直以來，育種工作者都是通過形態(tài)學(xué)分析測(cè)試來鑒定和選擇親本。這種方法耗時(shí)費(fèi)力，鑒定結(jié)果也易受環(huán)境干擾。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在分子水平上進(jìn)行親本菌株的選擇勢(shì)在必行[5]。

本研究應(yīng)用RAPD-PCR分子標(biāo)記的方法對(duì)金針菇菌株遺傳多樣性進(jìn)行分析，從22條引物中篩選出8條多態(tài)性豐富、譜帶清晰且重復(fù)性好的引物進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，8條引物均能將供試菌株區(qū)分開，表明RAPD分子標(biāo)記對(duì)金針菇菌株遺傳多樣性分析是可行的，并能把白色金針菇和黃色金針菇區(qū)分開來，與菌株農(nóng)藝性狀結(jié)果趨同。

但是，RAPD-PCR分子標(biāo)記技術(shù)也有缺點(diǎn)，即穩(wěn)定性和重復(fù)性不好，為了克服這些缺點(diǎn)，下一步的工作將開發(fā)由RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化的特定序列擴(kuò)增(SCAR，sequence characterized amplified region)標(biāo)記，相對(duì)于RAPD標(biāo)記[6]，SCAR標(biāo)記所用引物較長(zhǎng)且引物序列與模板DNA完全互補(bǔ)，可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行擴(kuò)增，因此結(jié)果穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強(qiáng)[7-8]，用SCAR標(biāo)記分析金針菇種質(zhì)資源更可靠。

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