益母草藥材中鹽酸水蘇堿的含量測定

陳 茜

（錦州市婦嬰醫(yī)院中藥局，遼寧 錦州 121000）

益母草（Leonurus heterophyllus[1]），是一年或者兩年生草本唇形科植物。味辛苦、性涼。作用活血祛瘀、利尿消腫，用于調(diào)節(jié)女性的月經(jīng)和緩解痛經(jīng)，還可治療胎漏難產(chǎn)、產(chǎn)后惡露不止、尿血以及便血等癥。益母草有多種化學(xué)成分，包括生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類等。其中主要的有效成分為生物堿，即為益母草堿 （leonurine，leo）、水蘇堿 (Stachydrine，sta)、益母草啶和益母草寧等。其中鹽酸水蘇堿為益母草藥材中的主要活性生物堿，本文主要采用了薄層層析法來對益母草藥材中鹽酸水蘇堿的含量進行測定。

1 材料與方法

1.1 儀器 雙波長薄層色譜掃描儀CS-930(日本島津)[2]；臥式層析槽；恒溫水浴鍋；噴霧器；微量定量毛細管；平整干凈的玻璃板；烘箱；研缽；量筒。

1.2 材料和試劑 益母草藥材；羧甲基纖維素鈉 (CMC）的水溶液；由海洋化工廠提供的硅膠G(青島)；來源于中國藥品生物制品檢定所的鹽酸水蘇堿（產(chǎn)品批號：110713-203116）；其他的試劑都是AR級的分析純。

1.3 薄層色譜法的層析條件與顯示劑 展開劑的配制是將正丁醇-鹽酸-醋酸乙酯按4∶1.5∶0.5的比例配好，且先倒入臥式層析槽中，蓋上表面皿，以待之后實驗使用。顯色劑則選用稀碘化鉍鉀試液。

1.4 研究方法

1.4.1 薄層色譜的制備 將羧甲基纖維素鈉 (CMC）的水溶液與硅膠G混合于研缽中，緩慢加入適量的水研磨，直至成糊狀后取出，并均勻地平鋪在玻璃板上，鋪板時可輕敲玻璃板以使其涂布均勻，整個平鋪面要求無氣泡，無疙瘩，特別是邊角的部分必須涂布均勻。完成鋪板后，在干凈平整的陰涼處晾干，再放入烘箱烘干，約30 min后拿出，備用。

1.4.2 益母草供試品溶液和鹽酸水蘇堿對照品溶液的制備 取出益母草藥材適量，研磨一定時間，使其成粉末狀，再精密稱定該細粉大約1 g并通過二號篩。將篩選后的粉末放置于錐形瓶中，向瓶中加入50 mL的99.7%乙醇試劑，然后將其加熱回流1.5 h，再放冷、濾過。濾過后的濾渣及容器需用50 mL的EtOH分3次洗滌，之后濾過、再合并濾液，再放到恒溫水浴鍋中蒸干。蒸干后的殘渣加入使其溶解的EtOH適量，再轉(zhuǎn)移到10 mL的量瓶中，然后同樣用EtOH稀釋至刻度并搖勻，放于離心機中以5000 r/min的速度離心5 min，最后取其上清液作為實驗所需的供試品溶液。精密吸取2 μL（1）與4 μL（2） 的供試品溶液。

精密稱取出適量的鹽酸水蘇堿對照品，再加入E－tOH制備成每1 mL中含有2 mg的鹽酸水蘇堿的溶液作為實驗用的對照品溶液[4]。(對照品溶液實際的濃度為 (C=2.04 mg/mL)。精密吸取對照品溶液1 μL(a)、2 μL(b)、4 μL(c)、6 μL(d)、8 μL(e)。

用微量定量毛細管分別蘸取益母草供試品溶液和鹽酸水蘇堿對照品溶液，于不同硅膠G薄層板的原點（距層析板下端2.0 cm處，斑點間距為1 cm） 上點樣，并作好供試品與對照品的標記。點樣完畢再放入臥式層析槽中層析，直至展開劑上升到距上邊沿0.5～1 cm時，立即取出硅膠G板，此時若斑點較為模糊，可用稀碘化鉍鉀試液噴濕以顯色，用薄層色譜儀CS-930掃描測定[4]。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線的制備 對照品溶液1 μL(a)、2 μL(b)、4 μL(c)、6 μL(d)、8 μL(e) ，所得峰面積值如表1所示。建立坐標曲線，對照品溶液的點樣量設(shè)置為橫坐標，峰面積設(shè)置為縱坐標。所得的線性回歸方程為：y=22389.1x+8129.8，r=0.9994。結(jié)果表明該藥材的鹽酸水蘇堿在2.3～16.4 μg范圍內(nèi)的濃度與峰面積擁有良好的線性關(guān)系[5]。

表1 對照品溶液峰面積值

2.2 精密度試驗結(jié)果 分別吸取6份對照品溶液2 μL，其次在同樣的硅膠G薄層板上點6個點，按上述方法測定，其峰面積積分值相對標準偏差RSD為1.8% (n=6)，證明此方法精密度較為良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果 對實驗中所用的同一塊硅膠G薄層板上的同一斑點進行掃描測定，每小時1次，共測定5次計算的峰面積值的相對標準差RSD=1.58%，（n=5），結(jié)果表明斑點穩(wěn)定性較好。

2.4 重現(xiàn)性性試驗結(jié)果 取同一樣品，按照上述供試品溶液的制備方法制成5份，按上述測定方法分別依法測定，所得的結(jié)果RSD=1.93%，結(jié)果表明該方法的重現(xiàn)性好。

2.5 樣品含量測定結(jié)果 先精密吸取4 μL的供試品溶液，2 μL與4 μL的對照品溶液按上述方法測定，用薄層掃描法來對其進行掃描，在波長為λs=510 nm時，可測量供試品吸光度積分值和對照品吸光度積分值[6]，再用兩點法計算，即得供試品的含量。結(jié)果見表2。

表2 供試品溶液含量測定結(jié)果

2.6 回收率試驗及結(jié)果 在此采用加樣回收法進行回收率試驗，首先在已知含量的益母草藥材中加入鹽酸水蘇堿的對照品適量，即加入對照品貯備液1 mL，再按含量測定的方法進行測定，結(jié)果見表3。

表3 益母草藥材的加樣回收率實驗

3 討論

《中華人民共和國藥典》2005年版的益母草含量測定法是以比例為1∶8∶3的乙酸乙酯-正丁醇-鹽酸的混合液為展開劑，再以稀碘化鉍鉀試液與三氯化鐵乙醇溶液 (10∶1)的混合溶液作為顯色劑[7]，應(yīng)用該方法在此藥材上實驗后，所表現(xiàn)出來的分離效果較差。再用雙波長掃描法來替代《藥典》的單波長掃描法后，明顯提高了結(jié)果的精確性。2010版的《中華人民共和國藥典》測定益母草中鹽酸水蘇堿含量是采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器檢測的方法[8-9]。該方法需采用氨基色譜柱，流動性則選用比例為90∶10的乙腈-水的混合液，此外還需采用硅藻土拌樣甲醇回流提取法提取，并制備成供試品溶液，該法操作上相對簡捷。但蒸發(fā)光散射檢測器有著較大的局限性——為避免不揮發(fā)物沉積在加熱室及光學(xué)檢測池體中，它的流動相要求全部蒸發(fā)。所以，只能使用揮發(fā)性的化合物來調(diào)節(jié)流動相的pH值，例如氨、醋酸和三氟乙酸等。

實驗結(jié)果表明，此次實驗選用的展開系統(tǒng)有較好的分離度，且所得斑點較為清晰；此方法簡便易行，測定的含量結(jié)果比較穩(wěn)定。且實驗過程中所用儀器試劑及操作步驟相對簡便易行，可用該方法快速檢測該藥材。

[1]Zhi-Ke Liu，Da-Rong Wu，Yi-Ming Shi，et al.Three new diterpenoids from Leonurus japonicus[J].Chinese Chemical Letters，2014，25（5）:677-679.

[2]汪愛霞，張惠萍，安雙生，等.前列泰片鹽酸水蘇堿定量測定方法改進[J].中成藥，2012，34(6):1188-1190.

[3]周潔菁，許釩，王欲斌，等.腦脈利顆粒中鹽酸水蘇堿的含量測定[J].醫(yī)學(xué)信息，2015(10):313-313.

[4]李向軍，王超，王永，等.中藥薄層色譜影響因素分析及應(yīng)用[J].中國藥業(yè)，2011，20（14）:13-15.

[5]邢慶芳.益母康顆粒中鹽酸水蘇堿快速鑒別的方法研究[J].按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué)，2012，3(4):26-26.

[6]高英，陳靜才，張在國，等.益母草顆粒的質(zhì)量研究[J].黑龍江科技信息，2015(17):21.

[7]鄧仙梅，趙斌，賈天柱，等.對《中國藥典》2010年版茺蔚子薄層鑒別方法的改進[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26（4）:893-894.

[8]張玉萌，項菲菲.益母草飲片中鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿含量測定[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，15（2）:73-74.

[9]南小航，宋婷，彭菲，等.不同產(chǎn)地益母草飲片中鹽酸水蘇堿含量差異分析[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，32(1):40-42.