基于單壁碳納米管陣列的克倫特羅無酶?jìng)鞲衅餮芯?/h1>
2018-03-02 19:02:53劉佳秦怡
分析化學(xué) 2018年2期 關(guān)鍵詞：碳納米管
劉佳+秦怡
摘 要 采用循環(huán)伏安法（CV）將單壁碳納米管（SWCNTs）鍵合在玻碳電極上，制備單壁碳納米管陣列（vSWCNT）修飾電極。羧基化碳納米管以乙二胺（EDA）為橋梁，形成酰胺鍵， 使碳納米管在玻碳電極（GCE）上有序穩(wěn)定排布。制備的vSWCNT電極穩(wěn)定性好，對(duì)鹽酸克倫特羅（CLE）的檢測(cè)靈敏度高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，碳納米管有規(guī)則的鏈接方式提高了利用效率。有序鍵合在電極表面的的碳納米管，因其良好的加速電子轉(zhuǎn)移作用、納米催化效應(yīng)及吸附作用，檢測(cè)CLE的峰電流較GCE提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。CLE濃度在10～120 ng/mL范圍內(nèi)與電極的響應(yīng)電流呈良好的線性關(guān)系。此電極用于人尿液中CLE的檢測(cè)，結(jié)果令人滿意。本研究制備的單壁碳納米管陣列電極作為新型高靈敏CLE電化學(xué)無酶?jìng)鞲衅?，可望進(jìn)一步開發(fā)用于實(shí)際臨床檢測(cè)。
關(guān)鍵詞 循環(huán)伏安法；鹽酸克倫特羅；碳納米管；單壁碳納米管陣列
1 引 言
鹽酸克倫特羅（Clenbuterol hydrochloride，CLE）作為典型的β受體興奮劑[1]，通常用于治療支氣管哮喘及抑郁癥[2]。因其可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和加快動(dòng)物生長(zhǎng)速度，CLE被非法添加于飼料中的事件時(shí)有發(fā)生。CLE被動(dòng)物吸收后，可殘留在肉及肝臟內(nèi)部，且半衰期長(zhǎng)。通過食物鏈被人體攝入的CLE過多，可引起心血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)疾病[3]。因此，食品中的CLE殘留分析至關(guān)重要。目前，CLE的分析檢測(cè)方法主要包括色譜、質(zhì)譜、毛細(xì)管電泳及免疫分析，這些方法通常需要昂貴的儀器、繁瑣的前處理工作、特定的環(huán)境或測(cè)定條件，不利于CLE的快速、實(shí)時(shí)檢測(cè)和監(jiān)管需求。
由于CLE中存在電活性的芳香基團(tuán)，可以采用電化學(xué)方法進(jìn)行分析檢測(cè)[4]。電化學(xué)傳感器以其靈敏度高、操作方便、檢測(cè)經(jīng)濟(jì)廉價(jià)而備受關(guān)注[5～8]。通過使用具有優(yōu)良的導(dǎo)電和催化性能的新型材料，構(gòu)建可加速電子轉(zhuǎn)移以及具有良好催化性質(zhì)的修飾表面，可促進(jìn)被檢測(cè)生物小分子的氧化還原反應(yīng)，提高電極界面的電催化活性及選擇性[9，10]。
碳納米管（CNTs）以其優(yōu)越的電催化活性及生物相容性在生物傳感器領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用[11～13]。CNTs修飾電極在CLE檢測(cè)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。首先，碳納米管具有高的比表面積及大π鍵，CLE的苯環(huán)易與碳管表面形成ππ共軛鍵而促進(jìn)電子在物質(zhì)與界面的傳遞，加速CLE的氧化還原。其次，CNTs上的缺陷形成的羧基鍵（COOH）與CLE的胺基鍵（NH2）之間的靜電作用，加速了CLE與電極之間電子傳遞。目前的文獻(xiàn)研究主要以CNTs與導(dǎo)電聚合物膜、導(dǎo)電納米金屬粒子或金屬氧化物混合，采用物理滴涂法制備傳感器界面，這種混合物的界面排列無序，催化位點(diǎn)不能有效利用。提升CNTs的表面位點(diǎn)的利用效率，CNTs的有序排布是關(guān)鍵。
相比于無序排列的碳納米管，有序排列的碳納米管可以改善表面的電化學(xué)性能及空間性能[14，15]，形成豎直取向的單壁碳納米管陣列，用來制備修飾電極，已成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究使用循環(huán)伏安法，以乙二胺為橋梁，制備有序排布的單壁碳納粹管（vSWCNTs）修飾電極，利用vSWCNTs在電極界面的有序性排列，及末端豐富的羧基基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)CLE的檢測(cè)。單壁碳納米管的有序排列使得碳納米管缺陷邊緣的羧基更加裸露在修飾電極外側(cè)，羧基峰電流明顯增大。羧基對(duì)CLE的胺基有弱吸附作用，CLE的加入導(dǎo)致羧基峰電流加大。對(duì)于同濃度的CLE，vSWCNTs/EDA/GCE 的響應(yīng)電流是GCE的16.1倍。 對(duì)10～120 ng/mL CLE， 修飾電極的羧基峰電流的增加與CLE濃度呈良好的線性關(guān)系，R2>0.995。以電化學(xué)制備的vSWCNTs/EDA/GCE檢測(cè)CLE的穩(wěn)定性好、靈敏度高。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器與試劑
CHI420A型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；三電極系統(tǒng)：玻碳電極為工作電極，飽合甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極。
鹽酸克倫特羅250 μg/mL，（上海玉博生物科技有限公司）； 羧基化單壁碳納米管（≥95%， 直徑1～2 nm， 美國(guó)SigmaAldrich）；實(shí)驗(yàn)中使用的溶液包括：250 μg/mL鹽酸克倫特羅、羧基化單壁碳納米管溶液 （2 mg SWCNTs 加入到5 mL 0.1 mol/L KCl溶液）、0.25 mol/L H2SO4溶液、重鉻酸鉀溶液（2.5% K2Cr2O7+10% HNO3）、乙二胺（EDA）溶液（5 mmol/L 乙二胺+0.1 mol/L KCl）、單壁碳納米管溶液（2 mg SWCNTs加入到5 mL 0.1 mol/L KNO3 中）。硫酸鹽緩沖溶液（pH 1～2）、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 3～8）；電化學(xué)測(cè)定的電解質(zhì)溶液為0.05 mmol/L K3Fe（CN）6+0.1 mol/L KCl）。以上試劑均為分析純。
2.2 vSWCNT/EDA/GCE 電極的制備
vSWCNT/EDA/GCE電極制備過程如圖1所示： （1）電極預(yù)處理 依次用0.3 mm和 0.05 mm Al2O3拋光玻碳電極，分別用HNO3溶液（1∶1，V/V）、去離子水超聲2～3 min；此后在0.25 mol/L H2SO4溶液中，用循環(huán)伏安法（CV， 1.0～1.0 V）掃描處理。用去離子水清洗干凈，在鐵氰化鉀溶液中 0.2～0.6 V循環(huán)伏安掃描，直至氧化峰與還原峰的電勢(shì)差ΔE<64 mV。（2）重鉻酸鉀氧化電極 在2.5%重鉻酸鉀溶液中，用循環(huán)伏安法對(duì)處理好的GCE電極進(jìn)行掃描（0 ～2.0 V）1～20個(gè)周期。（3）乙二胺酰胺化 將重鉻酸鉀氧化的GCE置于入5 mL乙二胺溶液中，以CV法（0～2.0 V）掃描5、10、15、20和25個(gè)周期，獲得EDA/GCE。（4）單壁碳納米管陣列的制備 將單壁碳納米管溶液超聲處理3～6 min，使其分散均勻，取5 mL放入反應(yīng)池中， 在高純氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將EDA/GCE電極用CV法（0～2.0 V）掃描5、10、15、20和25圈。endprint
3 結(jié)果與討論
3.1 修飾電極的表征
對(duì)GCE、EDA/GCE、vSWCNT/EDA/GCE的電化學(xué)催化性能進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，在pH 1.0的溶液中檢測(cè)16 μg/mL CLE時(shí)，EDA/GCE電極上CLE的響應(yīng)電流是GCE的4.2倍，這可能是基于電極表面乙二胺上胺基與CLE分子中的羧基之間的靜電吸引作用，促進(jìn)CLE的氧化還原，也說明CV法能使乙二胺有效鍵合在GCE。 vSWCNT/EDA/GCE的CLE峰電流進(jìn)一步增加，是EDA/GCE檢測(cè)電流的3.9倍，是GCE的16.1倍。此結(jié)果得益于表面鍵合碳納米管的優(yōu)良導(dǎo)電性能及催化性能。以CV法制備的vSWCNT/EDA/GCE，是以酰胺鍵鍵合單層有序排列的單壁碳納米管陣列，相比物理粘合法制備的碳管電極，電極表面的碳管修飾量明顯下降，但碳管的有序排列，使其活性催化位點(diǎn)能夠充分暴露，所以檢測(cè)CLE時(shí)呈現(xiàn)強(qiáng)的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。
裸電極修飾上乙二胺及碳納米管后，電極表面的顏色發(fā)生了變化。裸電極呈金屬銀顏色（圖3A），修飾乙二胺后，電極表面呈暗黃色（圖3B），而碳納米管與乙二胺交聯(lián)后vSWCNT/EDA/GCE電極表面呈現(xiàn)寶藍(lán)色金屬光澤（圖3C）。當(dāng)不采用乙二胺電化學(xué)修飾步驟，直接嘗試將鉻酸氧化后的GCE連接羧化碳納米管，電極表面不呈現(xiàn)寶藍(lán)色金屬光澤。此結(jié)果也證明了乙二胺與碳納米管已逐步修飾到電極上，乙二胺起到了橋梁的作用。也進(jìn)一步證明采用CV法制備了酰胺鍵聯(lián)接的單層碳納米管陣列。
3.2 鹽酸克倫特羅的檢測(cè)
CLE的檢測(cè)該選擇強(qiáng)酸性環(huán)境，但考慮電極表面鏈接碳納米管與GCE的酰胺鍵基團(tuán)在強(qiáng)酸條件容易被水解，因此考察了了電極的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，vSWCNTs/EDA/GCE在pH=1的條件下進(jìn)行CLE檢測(cè)，能夠穩(wěn)定使用1個(gè)月以上，電極性能沒有明顯下降。因此，選擇pH=1作為最佳檢測(cè)pH值。
3.2.3 修飾電極制備條件優(yōu)化 電極修飾界面修飾的羧基化碳納米管具有加速電極表面電子傳遞作用，因此，碳納米管陣列的修飾量非常關(guān)鍵。首先，采用重鉻酸鉀對(duì)玻碳電極進(jìn)行氧化，形成豐富的羧基官能團(tuán)。氧化劑的用量及氧化時(shí)間是影響電極性能的重要條件，氧化不足，表面的羧基位點(diǎn)少，形成的檢測(cè)位點(diǎn)少，從而影響物質(zhì)檢測(cè)的靈敏度；氧化過量，導(dǎo)致電極表面形成部分缺陷，同樣降低檢測(cè)位點(diǎn)。固定重鉻酸鉀濃度為2.5%（w/w），氧化數(shù)量的多少與電極的掃描圈數(shù)成正比。如圖6A所示，隨掃描圈數(shù)的增加，CLE的檢測(cè)峰電流先不斷上升，掃描5圈時(shí)，CLE的峰電流反而下降，表明氧化過度導(dǎo)致電極界面的有效作用位點(diǎn)減少。因此，選擇重鉻酸鉀溶液氧化的最佳掃描圈數(shù)為4圈。
電極被氧化后，與乙二胺在循環(huán)伏安法下進(jìn)行反應(yīng)，將乙二胺連接在電極表面。隨著在乙二胺溶液中的掃描圈數(shù)的增加，CLE的峰電流不斷增大（圖6B）。增至25圈時(shí)，CLE的峰沒有明顯增加。此外，乙二胺掃描圈數(shù)增加，所鍵合的碳管羧基峰電位正移（0.25 V），CLE檢出電位（0.40 V）接近，與CLE氧化峰部分重合（圖6C）。為了避免兩者電流的互相影響，乙二胺溶液的最佳優(yōu)化周期數(shù)定為20個(gè)循環(huán)。
將單壁碳納米管陣列鍵合在乙二胺修飾的電極上，隨著掃描圈數(shù)增加，峰電流增大（圖6D），但至25圈時(shí)，CLE峰電流較20圈上升很小。主要原因是掃描圈數(shù)越多，酰胺化反應(yīng)幾率越大，直至反應(yīng)飽和，增大反應(yīng)的圈數(shù)不能再促進(jìn)反應(yīng)。但隨著鍵合周期增加，電極表面羧基峰正移。鍵合25圈后，修飾電極的羧基峰與CLE的氧化峰部分重疊。為了避免兩者相互干擾，選擇CV掃描20圈數(shù)進(jìn)行碳納米管陣列的電化學(xué)合成。
3.3 vSWCNTs/EDA/GCE電極檢測(cè)CLE的分析性能
在最佳實(shí)驗(yàn)條件下制備的vSWCNTs/EDA/GCE電極，采用SWV法在pH 1體系中檢測(cè)CLE，修飾電極在0.42 V處有一對(duì)氧化還原峰，對(duì)CLE的檢出限為1.0 ng/m L（S/N=3）。隨著CLE濃度的增大，峰電流不斷增加。特別對(duì)低濃度范圍的CLE，峰電流增加與CLE濃度呈良好的線性關(guān)系。如圖7所示， 在10～120 ng/mL的CLE濃度范圍內(nèi)，碳納米管羧基峰電流的增加與CLE的濃度呈良好的線性關(guān)系， 線性方程為y=0.263x+16.924，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.995。表1比較了已報(bào)道的CLE無酶電化學(xué)傳感器檢測(cè)性能。基于碳管表面的大π鍵與CLE的苯環(huán)之間的共軛作用，及碳管有序排列后，修飾表面豐富的羧基官能團(tuán)與CLE胺基官能團(tuán)之間的靜電吸引作用，促進(jìn)了CLE在電極表面的富集，進(jìn)一步促進(jìn)氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行。此外，修飾層與電極界面以化學(xué)鍵結(jié)合，相比物理粘附，性能更穩(wěn)定。因此，電化學(xué)方法鍵合所得的vSWCNTs/EDA/GCE可作為高靈敏、高穩(wěn)定性的CLE傳感器。制備的碳納米管修飾電極穩(wěn)定性好，修飾層不易脫落。修飾好的電極在4℃放置一個(gè)月后，對(duì)CLE檢測(cè)的峰電流幾乎不變。
3.4 人尿樣中CLE的檢測(cè)
在人尿樣品中添加不同濃度水平的CLE，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)。如表2所示，加標(biāo)回收率為101%～103%， 在人尿樣中含有大量的尿酸和蛋白質(zhì)等共存物質(zhì)，并不影響對(duì)CLE的檢測(cè)。
4 結(jié) 論
本研究通過氧化玻碳電極使其表面生成羧基，與乙二胺形成酰胺鍵，再采用循環(huán)伏安法將羧基化單壁碳納米管陣列鍵合到GCE上，從而在電極表面有順序地形成單層SWCNT陣列。有序的碳納米管陣列具有高縱橫比、高催化活性及優(yōu)良的導(dǎo)電性能。通過碳納米管表面羧基與CLE胺基之間靜電作用，促使碳管表面羧基峰電流增加?；隰然咫娏髟黾优cCLE濃度的線性關(guān)系，制得高靈敏CLE傳感器。在pH 1的緩沖液中，以SWV法進(jìn)行CLE檢測(cè)，在人尿樣加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。
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Abstract Vertical singlewalled carbon nanotubes （vSWCNTs） array was constructed on glassy carbon electrode （GCE） by electrochemical method of electrocyclic voltammetry （CV method）. The synthesized electrode was very stable and was not easy to fall off. Via the amino groups of ethylenediamine （Ethylenediamine， EDA） and the carboxyl group of carboxylated carbon nanotubes， the SWCNTs were ordered to grow steadily on GCE（vSWCNTs/EDA/GCE）. The modified electrode was used to detect hydrochloric acid clenbuterol （CLE）. The experimental results showed that the regular link of carbon nanotubes on GCE improved its utilization efficiency. The detection sensitivity of clenbuterol was 16.1 times higher than that of the bare GCE. Due to electron accelerating effect and nanometer effect of SWCNTs， the carboxyl peak current of SWCNTs was increased with the added CLE. The carboxyl peak current of SWCNTs had a good linear relationship with CLE concentration in the range of 10-120 ng/mL. The method was successfully applied to the determination of CLE in real urine samples with good recoveries. Also vSWCNTs/EDA/GCE could be used as a new highly sensitive electrochemical sensor for CLE detection.
Keywords Cyclic voltammetry； Clenbuterol； Carbon nanotubes； Vertical singlewalled carbon nanotubes array
（Received 25 October 2017； accepted 11 December 2017）endprint
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鹽酸克倫特羅（Clenbuterol hydrochloride，CLE）作為典型的β受體興奮劑[1]，通常用于治療支氣管哮喘及抑郁癥[2]。因其可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和加快動(dòng)物生長(zhǎng)速度，CLE被非法添加于飼料中的事件時(shí)有發(fā)生。CLE被動(dòng)物吸收后，可殘留在肉及肝臟內(nèi)部，且半衰期長(zhǎng)。通過食物鏈被人體攝入的CLE過多，可引起心血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)疾病[3]。因此，食品中的CLE殘留分析至關(guān)重要。目前，CLE的分析檢測(cè)方法主要包括色譜、質(zhì)譜、毛細(xì)管電泳及免疫分析，這些方法通常需要昂貴的儀器、繁瑣的前處理工作、特定的環(huán)境或測(cè)定條件，不利于CLE的快速、實(shí)時(shí)檢測(cè)和監(jiān)管需求。
由于CLE中存在電活性的芳香基團(tuán)，可以采用電化學(xué)方法進(jìn)行分析檢測(cè)[4]。電化學(xué)傳感器以其靈敏度高、操作方便、檢測(cè)經(jīng)濟(jì)廉價(jià)而備受關(guān)注[5～8]。通過使用具有優(yōu)良的導(dǎo)電和催化性能的新型材料，構(gòu)建可加速電子轉(zhuǎn)移以及具有良好催化性質(zhì)的修飾表面，可促進(jìn)被檢測(cè)生物小分子的氧化還原反應(yīng)，提高電極界面的電催化活性及選擇性[9，10]。
碳納米管（CNTs）以其優(yōu)越的電催化活性及生物相容性在生物傳感器領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用[11～13]。CNTs修飾電極在CLE檢測(cè)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。首先，碳納米管具有高的比表面積及大π鍵，CLE的苯環(huán)易與碳管表面形成ππ共軛鍵而促進(jìn)電子在物質(zhì)與界面的傳遞，加速CLE的氧化還原。其次，CNTs上的缺陷形成的羧基鍵（COOH）與CLE的胺基鍵（NH2）之間的靜電作用，加速了CLE與電極之間電子傳遞。目前的文獻(xiàn)研究主要以CNTs與導(dǎo)電聚合物膜、導(dǎo)電納米金屬粒子或金屬氧化物混合，采用物理滴涂法制備傳感器界面，這種混合物的界面排列無序，催化位點(diǎn)不能有效利用。提升CNTs的表面位點(diǎn)的利用效率，CNTs的有序排布是關(guān)鍵。
相比于無序排列的碳納米管，有序排列的碳納米管可以改善表面的電化學(xué)性能及空間性能[14，15]，形成豎直取向的單壁碳納米管陣列，用來制備修飾電極，已成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究使用循環(huán)伏安法，以乙二胺為橋梁，制備有序排布的單壁碳納粹管（vSWCNTs）修飾電極，利用vSWCNTs在電極界面的有序性排列，及末端豐富的羧基基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)CLE的檢測(cè)。單壁碳納米管的有序排列使得碳納米管缺陷邊緣的羧基更加裸露在修飾電極外側(cè)，羧基峰電流明顯增大。羧基對(duì)CLE的胺基有弱吸附作用，CLE的加入導(dǎo)致羧基峰電流加大。對(duì)于同濃度的CLE，vSWCNTs/EDA/GCE 的響應(yīng)電流是GCE的16.1倍。 對(duì)10～120 ng/mL CLE， 修飾電極的羧基峰電流的增加與CLE濃度呈良好的線性關(guān)系，R2>0.995。以電化學(xué)制備的vSWCNTs/EDA/GCE檢測(cè)CLE的穩(wěn)定性好、靈敏度高。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器與試劑
CHI420A型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；三電極系統(tǒng)：玻碳電極為工作電極，飽合甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極。
鹽酸克倫特羅250 μg/mL，（上海玉博生物科技有限公司）； 羧基化單壁碳納米管（≥95%， 直徑1～2 nm， 美國(guó)SigmaAldrich）；實(shí)驗(yàn)中使用的溶液包括：250 μg/mL鹽酸克倫特羅、羧基化單壁碳納米管溶液 （2 mg SWCNTs 加入到5 mL 0.1 mol/L KCl溶液）、0.25 mol/L H2SO4溶液、重鉻酸鉀溶液（2.5% K2Cr2O7+10% HNO3）、乙二胺（EDA）溶液（5 mmol/L 乙二胺+0.1 mol/L KCl）、單壁碳納米管溶液（2 mg SWCNTs加入到5 mL 0.1 mol/L KNO3 中）。硫酸鹽緩沖溶液（pH 1～2）、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 3～8）；電化學(xué)測(cè)定的電解質(zhì)溶液為0.05 mmol/L K3Fe（CN）6+0.1 mol/L KCl）。以上試劑均為分析純。
2.2 vSWCNT/EDA/GCE 電極的制備
vSWCNT/EDA/GCE電極制備過程如圖1所示： （1）電極預(yù)處理 依次用0.3 mm和 0.05 mm Al2O3拋光玻碳電極，分別用HNO3溶液（1∶1，V/V）、去離子水超聲2～3 min；此后在0.25 mol/L H2SO4溶液中，用循環(huán)伏安法（CV， 1.0～1.0 V）掃描處理。用去離子水清洗干凈，在鐵氰化鉀溶液中 0.2～0.6 V循環(huán)伏安掃描，直至氧化峰與還原峰的電勢(shì)差ΔE<64 mV。（2）重鉻酸鉀氧化電極 在2.5%重鉻酸鉀溶液中，用循環(huán)伏安法對(duì)處理好的GCE電極進(jìn)行掃描（0 ～2.0 V）1～20個(gè)周期。（3）乙二胺酰胺化 將重鉻酸鉀氧化的GCE置于入5 mL乙二胺溶液中，以CV法（0～2.0 V）掃描5、10、15、20和25個(gè)周期，獲得EDA/GCE。（4）單壁碳納米管陣列的制備 將單壁碳納米管溶液超聲處理3～6 min，使其分散均勻，取5 mL放入反應(yīng)池中， 在高純氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將EDA/GCE電極用CV法（0～2.0 V）掃描5、10、15、20和25圈。endprint
3 結(jié)果與討論
3.1 修飾電極的表征
對(duì)GCE、EDA/GCE、vSWCNT/EDA/GCE的電化學(xué)催化性能進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，在pH 1.0的溶液中檢測(cè)16 μg/mL CLE時(shí)，EDA/GCE電極上CLE的響應(yīng)電流是GCE的4.2倍，這可能是基于電極表面乙二胺上胺基與CLE分子中的羧基之間的靜電吸引作用，促進(jìn)CLE的氧化還原，也說明CV法能使乙二胺有效鍵合在GCE。 vSWCNT/EDA/GCE的CLE峰電流進(jìn)一步增加，是EDA/GCE檢測(cè)電流的3.9倍，是GCE的16.1倍。此結(jié)果得益于表面鍵合碳納米管的優(yōu)良導(dǎo)電性能及催化性能。以CV法制備的vSWCNT/EDA/GCE，是以酰胺鍵鍵合單層有序排列的單壁碳納米管陣列，相比物理粘合法制備的碳管電極，電極表面的碳管修飾量明顯下降，但碳管的有序排列，使其活性催化位點(diǎn)能夠充分暴露，所以檢測(cè)CLE時(shí)呈現(xiàn)強(qiáng)的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。
裸電極修飾上乙二胺及碳納米管后，電極表面的顏色發(fā)生了變化。裸電極呈金屬銀顏色（圖3A），修飾乙二胺后，電極表面呈暗黃色（圖3B），而碳納米管與乙二胺交聯(lián)后vSWCNT/EDA/GCE電極表面呈現(xiàn)寶藍(lán)色金屬光澤（圖3C）。當(dāng)不采用乙二胺電化學(xué)修飾步驟，直接嘗試將鉻酸氧化后的GCE連接羧化碳納米管，電極表面不呈現(xiàn)寶藍(lán)色金屬光澤。此結(jié)果也證明了乙二胺與碳納米管已逐步修飾到電極上，乙二胺起到了橋梁的作用。也進(jìn)一步證明采用CV法制備了酰胺鍵聯(lián)接的單層碳納米管陣列。
3.2 鹽酸克倫特羅的檢測(cè)
CLE的檢測(cè)該選擇強(qiáng)酸性環(huán)境，但考慮電極表面鏈接碳納米管與GCE的酰胺鍵基團(tuán)在強(qiáng)酸條件容易被水解，因此考察了了電極的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，vSWCNTs/EDA/GCE在pH=1的條件下進(jìn)行CLE檢測(cè)，能夠穩(wěn)定使用1個(gè)月以上，電極性能沒有明顯下降。因此，選擇pH=1作為最佳檢測(cè)pH值。
3.2.3 修飾電極制備條件優(yōu)化 電極修飾界面修飾的羧基化碳納米管具有加速電極表面電子傳遞作用，因此，碳納米管陣列的修飾量非常關(guān)鍵。首先，采用重鉻酸鉀對(duì)玻碳電極進(jìn)行氧化，形成豐富的羧基官能團(tuán)。氧化劑的用量及氧化時(shí)間是影響電極性能的重要條件，氧化不足，表面的羧基位點(diǎn)少，形成的檢測(cè)位點(diǎn)少，從而影響物質(zhì)檢測(cè)的靈敏度；氧化過量，導(dǎo)致電極表面形成部分缺陷，同樣降低檢測(cè)位點(diǎn)。固定重鉻酸鉀濃度為2.5%（w/w），氧化數(shù)量的多少與電極的掃描圈數(shù)成正比。如圖6A所示，隨掃描圈數(shù)的增加，CLE的檢測(cè)峰電流先不斷上升，掃描5圈時(shí)，CLE的峰電流反而下降，表明氧化過度導(dǎo)致電極界面的有效作用位點(diǎn)減少。因此，選擇重鉻酸鉀溶液氧化的最佳掃描圈數(shù)為4圈。
電極被氧化后，與乙二胺在循環(huán)伏安法下進(jìn)行反應(yīng)，將乙二胺連接在電極表面。隨著在乙二胺溶液中的掃描圈數(shù)的增加，CLE的峰電流不斷增大（圖6B）。增至25圈時(shí)，CLE的峰沒有明顯增加。此外，乙二胺掃描圈數(shù)增加，所鍵合的碳管羧基峰電位正移（0.25 V），CLE檢出電位（0.40 V）接近，與CLE氧化峰部分重合（圖6C）。為了避免兩者電流的互相影響，乙二胺溶液的最佳優(yōu)化周期數(shù)定為20個(gè)循環(huán)。
將單壁碳納米管陣列鍵合在乙二胺修飾的電極上，隨著掃描圈數(shù)增加，峰電流增大（圖6D），但至25圈時(shí)，CLE峰電流較20圈上升很小。主要原因是掃描圈數(shù)越多，酰胺化反應(yīng)幾率越大，直至反應(yīng)飽和，增大反應(yīng)的圈數(shù)不能再促進(jìn)反應(yīng)。但隨著鍵合周期增加，電極表面羧基峰正移。鍵合25圈后，修飾電極的羧基峰與CLE的氧化峰部分重疊。為了避免兩者相互干擾，選擇CV掃描20圈數(shù)進(jìn)行碳納米管陣列的電化學(xué)合成。
3.3 vSWCNTs/EDA/GCE電極檢測(cè)CLE的分析性能
在最佳實(shí)驗(yàn)條件下制備的vSWCNTs/EDA/GCE電極，采用SWV法在pH 1體系中檢測(cè)CLE，修飾電極在0.42 V處有一對(duì)氧化還原峰，對(duì)CLE的檢出限為1.0 ng/m L（S/N=3）。隨著CLE濃度的增大，峰電流不斷增加。特別對(duì)低濃度范圍的CLE，峰電流增加與CLE濃度呈良好的線性關(guān)系。如圖7所示， 在10～120 ng/mL的CLE濃度范圍內(nèi)，碳納米管羧基峰電流的增加與CLE的濃度呈良好的線性關(guān)系， 線性方程為y=0.263x+16.924，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.995。表1比較了已報(bào)道的CLE無酶電化學(xué)傳感器檢測(cè)性能。基于碳管表面的大π鍵與CLE的苯環(huán)之間的共軛作用，及碳管有序排列后，修飾表面豐富的羧基官能團(tuán)與CLE胺基官能團(tuán)之間的靜電吸引作用，促進(jìn)了CLE在電極表面的富集，進(jìn)一步促進(jìn)氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行。此外，修飾層與電極界面以化學(xué)鍵結(jié)合，相比物理粘附，性能更穩(wěn)定。因此，電化學(xué)方法鍵合所得的vSWCNTs/EDA/GCE可作為高靈敏、高穩(wěn)定性的CLE傳感器。制備的碳納米管修飾電極穩(wěn)定性好，修飾層不易脫落。修飾好的電極在4℃放置一個(gè)月后，對(duì)CLE檢測(cè)的峰電流幾乎不變。
3.4 人尿樣中CLE的檢測(cè)
在人尿樣品中添加不同濃度水平的CLE，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)。如表2所示，加標(biāo)回收率為101%～103%， 在人尿樣中含有大量的尿酸和蛋白質(zhì)等共存物質(zhì)，并不影響對(duì)CLE的檢測(cè)。
4 結(jié) 論
本研究通過氧化玻碳電極使其表面生成羧基，與乙二胺形成酰胺鍵，再采用循環(huán)伏安法將羧基化單壁碳納米管陣列鍵合到GCE上，從而在電極表面有順序地形成單層SWCNT陣列。有序的碳納米管陣列具有高縱橫比、高催化活性及優(yōu)良的導(dǎo)電性能。通過碳納米管表面羧基與CLE胺基之間靜電作用，促使碳管表面羧基峰電流增加?；隰然咫娏髟黾优cCLE濃度的線性關(guān)系，制得高靈敏CLE傳感器。在pH 1的緩沖液中，以SWV法進(jìn)行CLE檢測(cè)，在人尿樣加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。
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Abstract Vertical singlewalled carbon nanotubes （vSWCNTs） array was constructed on glassy carbon electrode （GCE） by electrochemical method of electrocyclic voltammetry （CV method）. The synthesized electrode was very stable and was not easy to fall off. Via the amino groups of ethylenediamine （Ethylenediamine， EDA） and the carboxyl group of carboxylated carbon nanotubes， the SWCNTs were ordered to grow steadily on GCE（vSWCNTs/EDA/GCE）. The modified electrode was used to detect hydrochloric acid clenbuterol （CLE）. The experimental results showed that the regular link of carbon nanotubes on GCE improved its utilization efficiency. The detection sensitivity of clenbuterol was 16.1 times higher than that of the bare GCE. Due to electron accelerating effect and nanometer effect of SWCNTs， the carboxyl peak current of SWCNTs was increased with the added CLE. The carboxyl peak current of SWCNTs had a good linear relationship with CLE concentration in the range of 10-120 ng/mL. The method was successfully applied to the determination of CLE in real urine samples with good recoveries. Also vSWCNTs/EDA/GCE could be used as a new highly sensitive electrochemical sensor for CLE detection.
Keywords Cyclic voltammetry； Clenbuterol； Carbon nanotubes； Vertical singlewalled carbon nanotubes array
（Received 25 October 2017； accepted 11 December 2017）endprint
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