清潔級獺兔在豬瘟活疫苗質(zhì)量檢定中的敏感性研究

潘晶晶 吳潤生 高昔英 陳國蘭 鄭忠東 鄭立鋒 陳先進 詹先強 翁順太＊

（1.福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014；2.福建省人獸共患病研究重點實驗室 福建省疾病預(yù)防控制中心 福州 350001）

兔熱原檢查法是豬瘟活疫苗效價測定最經(jīng)典、最有效的方法之一，也是《中華人民共和國獸藥典》收錄的法定檢測方法。影響兔熱原檢查的因素除了飼養(yǎng)環(huán)境、試驗環(huán)境及試驗控制技術(shù)外，兔的品種、來源、日齡、體質(zhì)量及微生物控制等級等對熱原檢查結(jié)果也有很大影響。本研究選取清潔級日本大耳白兔、普通級日本大耳白兔、清潔級獺兔、非等級獺兔、非等級福建黃兔等進行對比試驗，目的是為了篩選出對豬瘟病毒更敏感、熱原反應(yīng)更穩(wěn)定的兔品種，觀察不同微生物控制等級的試驗兔對豬瘟病毒的敏感性差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用兔及設(shè)施 清潔級獺兔由本課題組自行培育提供，生產(chǎn)許可證 SCXK（閩）2016-0001；清潔級日本大耳白兔由青島康大生物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證 SCXK（魯）2015-0003；普通級日本大耳白兔由福建省連江玉華山自然生態(tài)農(nóng)業(yè)試驗場提供，生產(chǎn)許可證SCXK（閩）2014-0001；福建黃兔由福州某黃兔養(yǎng)殖場提供，所有試驗用兔外觀無異常；非等級獺兔由浙江某獺兔養(yǎng)殖場提供，所有試驗用兔外觀無異常。以上試驗兔體質(zhì)量為1.5～3.0 kg，日齡為80～110日齡，性別不限。實驗室使用許可證號為 SYXK（閩）2016-0002。

1.1.2 供試樣品 批次1：豬瘟活疫苗（兔源），由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號為2017011。批次2：豬瘟活疫苗工作抗原，由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號為2016001。

1.1.3 試驗器具 2 mL注射器、20 mL試管、10 mL移液管、1 mL移液管、滅菌生理鹽水、試驗兔固定架、水銀體溫計。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗前準(zhǔn)備

1.2.1 分組 分別設(shè)立清潔級日本大耳白兔、清潔級獺兔、普通級日本大耳白兔、非等級獺兔、非等級福建黃兔等5個組別，每組各72只。

1.2.2 正常體溫檢測 試驗兔于正式試驗開始前2 d進行正常體溫的測量，每日選擇10:00和16:00兩個時間段測溫，共測量5個溫次。選取5個溫次的溫差不超過0.5℃的試驗兔進行試驗，5次體溫的平均值作為試驗兔的基礎(chǔ)體溫。測溫時將兔仰臥放置于特定的固定架中，體溫計水銀球置入肛門內(nèi)3～4 cm，3 min后讀取并記錄。

1.2.3 稀釋接種 將供試樣品用滅菌生理鹽水稀釋成不同稀釋度，通過耳緣靜脈接種不同試驗兔，劑量為每只1.0 mL。接種后，上午、下午各測體溫1次。48 h后，每隔6 h測體溫1次，根據(jù)體溫變化曲線進行綜合判定。先利用少量動物（2～4只/批次）進行敏感性排查，一旦確定終點反應(yīng)后再進行較大量動物（20 只/批次）試驗。

1.2.4 結(jié)果判定 接種供試樣品后，兔的體溫反應(yīng)有以下四種。具體判定標(biāo)準(zhǔn)參照《中華人民共和國獸藥典》[1]。

1.2.4.1 定型熱反應(yīng)（++） 潛伏期48～96 h，體溫上升呈明顯曲線，至少有3個溫次升高1℃以上，并稽留 18～36 h。

1.2.4.2 輕熱反應(yīng)（+） 潛伏期48～96 h，體溫上升呈明顯曲線，至少有2個溫次升高0.5℃以上，并稽留 12～36 h。

1.2.4.3 可疑反應(yīng)（±） 潛伏期48～96 h，體溫曲線起伏不定，稽留不到12 h；或潛伏期在24 h以上，不足48 h及超過96 h至120 h出現(xiàn)熱反應(yīng)。1.2.4.4 無反應(yīng)（-） 體溫正常。

1.3 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計處理軟件進行單因素方差分析和LSD多重比較。

2 結(jié) 果

1）將兩批供試樣品均稀釋成1:750頭份/mL、1:900頭份/mL、1:1 050頭份/mL等三個稀釋度，各接種 2只 80～90 d、2.0～2.25 kg試驗兔。檢測結(jié)果見表1-表 2。

表1 批次1檢測結(jié)果

表2 批次2檢測結(jié)果

2）從表1和表2可以看出，批次1和批次2的檢測結(jié)果大同小異。因此，接下來4個階段只進行批次2的檢驗。提高樣品的稀釋度，將批次2供試樣品稀 釋 成 1:1 350 頭 份/mL、1:1 650 頭 份 /mL、1:1 950頭份/mL等三個稀釋度，各接種100～110 d、2.25～2.5 kg試驗兔。檢測結(jié)果見表3。

表3 批次2第二階段檢測結(jié)果

3）繼續(xù)提高樣品稀釋度，將批次2供試樣品稀釋成1:2 800頭份/mL、1:3 000頭份/mL、1:3 200頭份/mL等三個稀釋度，各接種2只80～85 d、1.75～2.0 kg試驗兔。檢測結(jié)果見表4。

表4 批次2第三階段檢測結(jié)果

4）進一步提高稀釋度并加大樣本數(shù)量，將批次2供試樣品稀釋成1:3 400頭份/mL、1:3 600頭份/mL 等兩個稀釋度，各接種 4只 85～90 d、2.0～2.25 kg試驗兔。檢測結(jié)果見表5。

表5 批次2第四階段檢測結(jié)果

5）臨近終點，再次提高稀釋度并加大樣本數(shù)量，將批次1、批次2供試樣品分別稀釋成1:3 800頭份/mL， 各接種 20只 85～90 d、2.0～2.25 kg試驗兔。檢測結(jié)果見表6-表7；各組別體溫變化曲線（隨機選取批次2的10只試驗兔）見圖1-圖5。

表6 批次1第五階段檢測結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 試驗過程設(shè)計與條件摸索 剛開始試驗階段，為找到試驗兔接近反應(yīng)終點的樣品稀釋度，結(jié)合動物的日齡與體質(zhì)量，不斷從低稀釋度到高稀釋度進行檢測，此時的動物就像試金石。從試驗第一階段到第四階段，全部試驗兔均由本課題組自繁自育，沒有免疫接種，也不存在運輸應(yīng)激，完全依托科學(xué)化管理來提高動物質(zhì)量。從試驗結(jié)果可以看出，由于動物質(zhì)量的提升，體溫變化的差異并不明顯。

表7 批次2第五階段檢測結(jié)果

圖1 批次2清潔級日本大耳白兔（1∶3 800）

圖2 批次2清潔級獺兔（1∶3 800）

圖3 批次2普通級日本大耳白兔（1∶3 800）

圖4 批次2非等級獺兔（1∶3 800）

3.2 低稀釋度下各組試驗兔對豬瘟病毒的敏感性比較 對五組試驗兔分別接種不同稀釋度的豬瘟病毒后的熱原反應(yīng)進行對比，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計處理軟件進行檢驗，結(jié)果差異并不顯著（P＞0.05）。由此可見，在1:750、1:900、1:1 050稀釋度時幾個品種兔的敏感性差異并不顯著，從表1-表3可以看出，在低稀釋度時五組試驗兔均有較好的熱原反應(yīng)，反應(yīng)率無明顯差異。將稀釋度提高至1:1 350、1:1 650、1:1 950時，清潔級日本大耳白兔、清潔級獺兔和非等級獺兔略優(yōu)于普通級大耳白兔和非等級福建黃兔，但差異仍不明顯。這可能與低稀釋度下，病毒效價比較高，對動物的敏感性同樣較高有關(guān)。

3.3 高稀釋度下各組試驗兔對豬瘟病毒的敏感性比較 高稀釋度時，同樣的環(huán)境條件、相近的日齡與體重（80～110 d、1.75～2.5 kg），五組試驗兔的反應(yīng)率開始體現(xiàn)出較大的差異，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計處理軟件進行檢驗，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。從表 4 可以看出，1:2 800、1:3 000、1:3 200 三個稀釋度，清潔級試驗兔的反應(yīng)情況明顯優(yōu)于普通級或非等級試驗兔；從表5可以看出，1:3 400稀釋度，清潔級獺兔、清潔級日本大耳白兔及非等級獺兔的定型熱反應(yīng)率均為100%，普通級日本大耳白兔的定型熱反應(yīng)率為80%，非等級福建黃兔的定型熱反應(yīng)率為50%。在1:3 600稀釋度時，清潔級獺兔的定型熱反應(yīng)率為 100%（其中以 85～90 d、2.0～2.25 kg的獺兔反應(yīng)為最佳），清潔級日本大耳白兔與非等級獺兔的定型熱反應(yīng)均為80%，普通級日本大耳白兔和非等級福建黃兔的定型熱反應(yīng)率均為50%。從表6-表7可以看出，1:3 800稀釋度時，清潔級獺兔的定型熱反應(yīng)率為95%，清潔級日本大耳白兔的定型熱反

應(yīng)率為77.5%，非等級獺兔的定型熱反應(yīng)率為75%，普通級日本大耳白兔的定型熱反應(yīng)率為27.5%，非等級福建黃兔的定型熱反應(yīng)率為50%。從圖1-圖5的體溫變化曲線可以看出，清潔級獺兔的體溫變化曲線更為穩(wěn)定，接種后的升溫時間點、升溫持續(xù)時間、體溫曲線變化最為接近，同一稀釋度下對豬瘟病毒的敏感性無明顯個體差異。高反應(yīng)率及穩(wěn)定的體溫曲線變化，清潔級獺兔成為豬瘟活疫苗質(zhì)量檢定首選目標(biāo)性等級試驗兔。

3.4 引起敏感性差異的原因

3.4.1 品種間的敏感性差異 日本大耳白兔、獺兔、福建黃兔三個品種兔對豬瘟病毒均有較高的敏感性，特別在低稀釋度時的熱型反應(yīng)都非常穩(wěn)定，隨著稀釋度的不斷升高，三個品種兔對豬瘟病毒的敏感性差異也逐漸體現(xiàn)，其中清潔級獺兔在反應(yīng)率與體溫變化曲線方面均明顯優(yōu)于其他品種兔，可見經(jīng)過凈化培育的獺兔用于豬瘟病毒熱原檢查，其敏感性顯著高于其他品種兔。這一結(jié)果與詹先強等[2]研究結(jié)果一致。符合實驗動物國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的等級獺兔更有優(yōu)勢、更有保障。

3.4.2 飼養(yǎng)管理差異引起的敏感性差異 在高稀釋度對比時，清潔級試驗兔的反應(yīng)情況明顯優(yōu)于普通級的試驗兔，二者之間最大的差異體現(xiàn)在飼養(yǎng)管理方面。清潔級試驗兔生產(chǎn)管理更為規(guī)范，動物種群維持較好，寄生蟲和微生物控制水平也更為嚴(yán)格，而普通級試驗兔屬于開放飼養(yǎng)，衛(wèi)生管理制度不規(guī)范、不嚴(yán)格，飼養(yǎng)環(huán)境簡易、開放，飼養(yǎng)設(shè)施濕度、通風(fēng)換氣等指標(biāo)不理想，存在采用自制或無生產(chǎn)許可證企業(yè)生產(chǎn)的飼料、繁殖種群小或直接從農(nóng)戶收購、濫用抗生素和藥物等問題，這些因素是導(dǎo)致家兔品質(zhì)不穩(wěn)定的主要原因[3]。普通級日本大耳白兔早已入選國家實驗動物名錄，質(zhì)量上可以滿足檢驗要求。前四階段所使用非等級獺兔一直自繁自育，質(zhì)量理應(yīng)可以保證，即使是第五階段外購的非等級獺兔，其反應(yīng)也比非等級福建黃兔好，這可能與培育過程和經(jīng)濟利益有關(guān)系，皮用獺兔注重皮張質(zhì)量，如果日常管理不到位，勢必造成獺兔質(zhì)量差從而降低皮張等級，影響經(jīng)濟利益。

3.4.3 日齡與體重的影響 不同來源、不同品種的試驗兔，由于品種間差異、管理水平差異，往往造成動物日齡記錄不準(zhǔn)確、體質(zhì)量參差不齊，最終影響檢測結(jié)果。即使是同樣環(huán)境條件、同樣營養(yǎng)水平、相近日齡、同樣的免疫程序，也可能造成體質(zhì)量的差異，如日本大耳白兔的增重效果比獺兔和福建黃兔要好。實踐中到底是以試驗兔的體質(zhì)量為選擇指標(biāo)還是以日齡來衡量？在《中華人民共和國獸藥典》中僅規(guī)定體重1.5～3.0 kg的試驗兔，對日齡并未作出規(guī)定，該范圍選擇過于寬泛。筆者認(rèn)為應(yīng)該以動物的日齡為衡量指標(biāo)，輔以界定動物的體質(zhì)量，這樣才能反映出動物的正常生理發(fā)育狀況。

筆者在長期從事獸用疫苗質(zhì)量檢定工作中，摸索出最能接近疫苗正常反應(yīng)的動物日齡與體質(zhì)量的大致標(biāo)準(zhǔn)，即 105～110 d、2.25～3.0 kg 的兔源反應(yīng)率最高。本試驗結(jié)果提示 85～90 d、2.0～2.25 kg的獺兔在高稀釋度時反應(yīng)率最好，這無形中就降低了試驗獺兔的利用日齡與體質(zhì)量，也降低動物的飼養(yǎng)周期，進而降低動物的飼養(yǎng)成本和管理成本。

3.4.4 應(yīng)激引起的敏感性差異 家兔機敏，易受驚，對環(huán)境條件變化的反應(yīng)特別敏感。在運輸過程中擁擠、長途顛簸，試驗兔難免存在生理應(yīng)激、心理應(yīng)激、氣候應(yīng)激、饑渴應(yīng)激，加上飼養(yǎng)環(huán)境條件改變造成的應(yīng)激等，都是造成敏感性差異的影響因素。由于試驗兔對體溫變化非常敏感，最易產(chǎn)生發(fā)熱反應(yīng)，因此，為保證檢驗的準(zhǔn)確性，首先運輸車輛應(yīng)能滿足運輸動物的基本福利要求，其次在購入試驗兔后要酌情延長檢疫觀察的周期，加強飼養(yǎng)管理，待試驗兔適應(yīng)新環(huán)境、體溫趨于穩(wěn)定后才能進行相關(guān)試驗[4-6]。

3.4.5 免疫應(yīng)答引起的敏感性差異 經(jīng)濟動物是允許進行計劃免疫的，如兔出血熱病毒、狂犬病病毒、犬瘟熱病毒等。而從實驗動物角度，除普通級動物外，其他等級動物是不允許進行免疫接種的。五組試驗兔中，雖然普通級日本大耳白兔和非等級獺兔可以免疫，但前四階段均采取自繁自育的繁殖模式，管理措施相對科學(xué)規(guī)范，沒有進行任何免疫接種，故敏感性檢測差異并不大 （當(dāng)然與供試樣品的稀釋度低有很大關(guān)系）。第五階段，除清潔級獺兔和日本大耳白兔仍采取自繁自育外，其他兔源全部外購，敏感性試驗的差異性即顯現(xiàn)出來。固有的免疫接種是否會與其他試驗產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用，機制尚不明確，有待相關(guān)試驗予以佐證。

3.4.6 隱性感染引起的敏感性差異 有許多動物疫病是以隱性感染存在的，臨床上并不表現(xiàn)出癥狀。一旦受長途運輸應(yīng)激、試驗干擾、免疫刺激等因素影響，癥狀就可能顯現(xiàn)，如鼠肝炎病毒、泰澤氏菌等。病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲感染都能從多方面改變動物機體的生理功能，這種改變無疑將影響到動物的免疫系統(tǒng)。病毒感染引起的免疫抑制表現(xiàn)為干擾正常免疫系統(tǒng)的功能、改變抗原的吸收和處理、破壞抗體形成細(xì)胞和漿細(xì)胞（如白血病病毒）[7]。第五階段，外購的試驗兔是否攜帶隱性感染疫病，在試驗處置條件下影響試驗結(jié)果，尚需進一步考證。

[1]中國獸藥典委員會.《中華人民共和國獸藥典》2015年版三部CVP3/2015/HYM/039:103-104.

[2]詹先強,姚堯,翁順太,等.不同品種兔對豬瘟兔化弱毒疫苗敏感性的研究[J].醫(yī)學(xué)動物防制,2017,33(3):304-306.

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[4]胡艷,郭禮榮,鄧勇波,等.應(yīng)激對普通級實驗兔生產(chǎn)的影響及其防控[J].中國養(yǎng)兔,2009(5):31-33.

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[6]王慧,符欣蕙.探討熱原試驗中影響試驗數(shù)據(jù)的因素[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進展,2016,44(1):32-34.

[7]孫以方.醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)[M].蘭州:蘭州大學(xué)出版社,2005.