CCL3促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并抑制其外泌體的分泌*

段鋒祺， 陳麗璇， 周 兆， 高 揚(yáng)， 劉革修， 韓 娜， 肖 揚(yáng)

(1南方醫(yī)科大學(xué)， 廣東 廣州 510515； 2廣州中醫(yī)藥大學(xué)， 廣東 廣州510405； 3暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510632； 4廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院， 廣東 廣州 510010； 5廣東省賽萊拉干細(xì)胞研究院， 廣東 廣州 510320)

外泌體(exosomes)最初發(fā)現(xiàn)于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞[1]，是來源于細(xì)胞的粒徑在30～100 nm的膜性小泡，最初被認(rèn)為是一種“細(xì)胞垃圾”[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中含有RNA和微小RNA(microRNA， miRNA)，并且能轉(zhuǎn)導(dǎo)入受體細(xì)胞而調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，證明外泌體不僅是一種細(xì)胞信息傳遞分子，更是一種遺傳物質(zhì)傳遞載體[3]，是細(xì)胞間信息交流的樞紐[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是產(chǎn)生外泌體能力最強(qiáng)的細(xì)胞，并且間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體(MSC-exosomes)具有多種與MSCs相似的生物學(xué)功能[5-7]。有研究發(fā)現(xiàn)， MSCs的旁分泌調(diào)節(jié)作用主要通過細(xì)胞分泌的外泌體來實(shí)現(xiàn)[8]。因此， MSCs旁分泌調(diào)節(jié)作用的強(qiáng)弱與外泌體分泌量有直接關(guān)系。

研究顯示,在炎癥病理環(huán)境下MSCs外泌體分泌呈活躍狀態(tài)[9]。有學(xué)者利用干擾素γ模擬炎癥環(huán)境，證實(shí)在此炎癥環(huán)境下， MSCs外泌體分泌量會增加[10]。研究表明， 在不同的炎癥病理環(huán)境下均能檢測到趨化因子CCL3高表達(dá)[11-13]。CCL3是經(jīng)脂多糖(lipopolysaccharides， LPS)誘導(dǎo)后在巨噬細(xì)胞上清液中發(fā)現(xiàn)的相對分子量約為8 kD的2個肽鏈組成的細(xì)胞因子。 多種細(xì)胞具有分泌CCL3的能力,其作用無種屬特異性。 CCL3的受體有CCR1、CCR5和CCR9，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體，CCL3與相應(yīng)受體特異性結(jié)合后產(chǎn)生瀑布樣細(xì)胞活化作用[14]。目前尚無文獻(xiàn)報道CCL3與人骨髓MSCs(human bone marrow MSCs， hBMSCs)的相互作用關(guān)系，本研究擬探討炎癥因子CCL3對hBMSCs外泌體分泌的調(diào)節(jié)作用，以進(jìn)一步了解CCL3對MSCs生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)作用。

材 料 和 方 法

1材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用間充質(zhì)干細(xì)胞均由廣州軍區(qū)總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心以及廣東省賽萊拉干細(xì)胞研究院提供。胎牛血清和低糖DMEM培養(yǎng)基購于Gibco；0.25%胰酶、青霉素和鏈霉素購于Sigma-Aldrich；外泌體提取試劑盒購于System Biosciences；CCK-8試劑購于日本同仁；鼠抗人CD9抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購于Abcam；Dynabeads購于Invitrogen。鼠抗人CD191(CCR1)、CD195(CCR5)和CD199(CCR9)單抗以及CCL3均購于PeproTech。15 cm培養(yǎng)皿和T25培養(yǎng)瓶購于Corning。

2主要方法

2.1hBMSCs的體外分離培養(yǎng)和鑒定 經(jīng)患者知情同意，采集健康供者額骨內(nèi)骨髓20 mL，肝素鈉抗凝后加等量生理鹽水， Percoll細(xì)胞分離液(1.073×10-3g/L)密度梯度離心，取中間單核細(xì)胞層以低糖DMEM培養(yǎng)基清洗2次，接種入15 cm 培養(yǎng)皿中，加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基后， 置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液，棄未貼壁的細(xì)胞。以后每2～3 d換液，待細(xì)胞生長至90%匯合后胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，記為P1。使用P3～P5細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，P5細(xì)胞進(jìn)行表面抗原及成骨和成脂誘導(dǎo)鑒定。

2.2CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取P3～P5 hBMSCs制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)，取8×104個細(xì)胞接種于96孔板，每孔3 000個。實(shí)驗(yàn)分為4個組，每組設(shè)4個復(fù)孔，同時設(shè)置不加細(xì)胞和藥物的培養(yǎng)基為空白對照(blank conrtol， control)組。各組對應(yīng)加入CCL3，使孔中CCL3終濃度分別為 0 μg/L、 5 μg/L、 10 μg/L和20 μg/L。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK8試劑8 μL，混勻后繼續(xù)孵育3 h。在酶標(biāo)儀上測定 450 nm 波長處的各孔吸光度(A)并計算細(xì)胞活力。

2.3活細(xì)胞計數(shù)檢測細(xì)胞增殖 將P3～P5 hBMSCs接種于T25的培養(yǎng)瓶中。CCL3加入各組細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使培養(yǎng)瓶中CCL3終濃度分別為0 μg/L、5 μg/L 、10 μg/L和20 μg/L。在37 ℃、5% CO2且飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集所有hBMSCs，并計數(shù)各組細(xì)胞。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面受體 將P3～P5 hBMSCs接種于T25的培養(yǎng)瓶中。CCL3加入各組細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使培養(yǎng)瓶中CCL3終濃度分別為0和10 μg/L。在37 ℃、5% CO2、 飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集所有hBMSCs， PBS洗1遍，分別以5 μL抗CCR1、CCR5和CCR9單抗重懸，室溫避光反應(yīng)30 min。離心取細(xì)胞沉淀后用1 mL PBS洗滌，收集細(xì)胞沉淀用100 μL PBS重懸后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5外泌體分離提純 取P3～P5 hBMSCs，培養(yǎng)至達(dá)到80%融合時，更換無血清低糖DMEM培養(yǎng)基，饑餓處理24 h后收集上清，按照ExoQuickTM試劑盒(SBI)操作說明提取外泌體，將提取的外泌體加入100 μL PBS重懸，-80 ℃凍存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6電鏡鑒定外泌體形態(tài) 取上述分離純化外泌體懸液10 μL，加入等體積平衡鹽PBS溶液稀釋，滴加于直徑2 mm的載樣銅網(wǎng)上，于室溫靜置1分鐘后， 用濾紙將多余液體輕輕吸去；用3%磷鎢酸鈉溶液(pH 6.8)室溫復(fù)染5 min，用雙蒸水輕輕洗一遍后室溫晾干2 min；于透射電鏡觀察并照相。各視野區(qū)隨機(jī)選取20個外泌體測量其直徑。

2.7納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis， NTA) 取各組分離純化外泌體懸液1 μL，加入等體積平衡鹽PBS溶液稀釋至NTA軟件畫面中粒子束不超過100個。根據(jù)Nanosight-NS500記錄的顆粒數(shù)，按照儀器使用說明書上機(jī)進(jìn)行納米粒子特性分析，待儀器測量結(jié)束后，收集并分析報告。

2.8外泌體流式細(xì)胞術(shù) BCA法對分離純化的外泌體進(jìn)行蛋白定量，取各組外泌體30 μg分別與0.5 μL Dynabeads混勻，室溫旋轉(zhuǎn)孵育15 min，加入1 mL PBS，4 ℃ 旋轉(zhuǎn)孵育過夜；孵育完畢后加入100 mmol/L 甘氨酸和2%BSA以終止反應(yīng)，室溫旋轉(zhuǎn)孵育30 min，14 800×g離心1 min后用2% BSA洗滌1次；用3% BSA封閉，室溫旋轉(zhuǎn)孵育30 min，14 800×g離心1 min后2%BSA洗滌1次；加入鼠源CD9抗體(1∶2 000)，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育30 min，14 800×g離心1 min；再次用2% BSA洗滌 1 次；加入鼠源488抗體(1∶2 000)，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育30 min；上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

3統(tǒng)計學(xué)處理

本研究所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析，GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計繪圖。兩組間的比較采用t檢驗(yàn)；多組間的比較采用單因素方差分析，均數(shù)間的多重比較采用Bonferroni 法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1hBMSCs表面抗原流式細(xì)胞術(shù)鑒定

經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)檢測，可見細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)CD73(100%)、CD90(99.5%)和CD105(99.7%),弱陽性表達(dá)CD34(0.2%)、CD45(0.1%)和CD19(0.1%)，見圖1。

Figure 1. Results of surface antigen expression in hBMSCs.

圖1hBMSCs表面抗原檢測結(jié)果

2hBMSCs成脂和成骨誘導(dǎo)鑒定

P5 hBMSCs形態(tài)比較一致，呈成纖維細(xì)胞狀，貼壁生長，見圖2A。成脂誘導(dǎo)第14天可見大部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大而圓的脂滴，經(jīng)過油紅O染色后，脂滴紅染,見圖2B。成骨誘導(dǎo)第21天，可見細(xì)胞不斷增殖、重疊，而且出現(xiàn)很多鈣化結(jié)節(jié)，鈣化結(jié)節(jié)經(jīng)茜素紅染后呈紅色，見圖2C。

3CCL3對hBMSCs的促增殖作用

CCL3對hBMSCs增殖有明顯的促進(jìn)作用。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果和活細(xì)胞計數(shù)顯示，當(dāng)CCL3濃度為5 μg/L時，其對hBMSCs增殖已有明顯的促進(jìn)作用(P<0.05)。隨著濃度的增加，CCL3對hBMSCs增殖的促進(jìn)作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，見圖3。

4CCL3可誘導(dǎo)hBMSCs表面受體CCR9表達(dá)

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，hBMSCs表面存在CCL3的3個特異性受體CCR1、CCR5和CCR9。10 μg/L CCL3作用hBMSCs后，與對照(0 μg/L CCL3)組相比，CCR9組熒光強(qiáng)度峰值明顯右移，說明加入CCL3后hBMSCs表面CCR9表達(dá)量增加；CCR1和CCR5組峰值與對照組峰值基本重疊，說明CCR1和CCR5表達(dá)量無明顯差異，見圖4。這一結(jié)果提示CCL3可誘導(dǎo)hBMSCs表面受體CCR9表達(dá)。

Figure 2. The culture and identification of hBMSCs (×100). A: morphology of hBMSCs; B and C: multi-lineage differentiation abi-lity of hBMSCs (B: adipogenic induction; C: osteogenic induction).

圖2hBMSCs成脂和成骨誘導(dǎo)結(jié)果

Figure 3. CCL3 promoted the proliferation of hBMSCs in a dose-dependent manner. A: the viability of hBMSCs was measured by CCK-8 assay; B: viable hBMSCs were measured by viable cell counting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg/L group；#P<0.05vs5 μg/L group；△P<0.05vs10 μg/L group.

圖3CCK-8法和活細(xì)胞計數(shù)檢測CCL3對hBMSCs增殖的影響

Figure 4. CCL3 induced the expression of CCR9 on hBMSCs.

圖4CCL3通過表面受體CCR9作用于hBMSCs

5外泌體電鏡鑒定結(jié)果

在透射電鏡下觀察，hBMSCs外泌體呈圓形或橢圓形，直徑約30～100 nm[(88.3±26.4) nm]，有完整的包膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)含低密度物質(zhì)，見圖5。

6不同濃度CCL3對hBMSCs外泌體分泌量的影響

不同濃度(0、10和20 μg/L)的CCL3作用于hBMSCs后，提取上清液中的外泌體，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對照(0 μg/L)組CD9+外泌體百分比為65.60%±2.10%，10 μg/L組為51.33%±5.42%選取直徑為30～100 nm的外泌體納入計算。與對照(0 μg/L)組相比，CCL3作用后， hBMSCs外泌體的分泌量均明顯減低(P<0.05)，外泌體的平均粒徑增大(P<0.05)，見表1。CCL3影響hBMSCs外泌體的粒徑分布，并且其分泌的粒徑大于100 nm的微囊泡明顯增多， 見圖7、 8。

Figure 5. Morphology of hBMSCs-derived exosomes observed by transmission electron microscopy. The scale bar=100 nm.

圖5透射電鏡觀察hBMSCs來源外泌體的形態(tài)

(P<0.01)，20 μg/L組為21.27%±4.93%(P<0.01),見圖6。這說明CCL3抑制了hBMSCs外泌體的分泌。

討 論

趨化因子在調(diào)控免疫細(xì)胞到達(dá)受體組織的過程中發(fā)揮了重要作用。研究表明， CCL3與多種呼吸系統(tǒng)疾病、腫瘤免疫以及血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在MSCs的體外研究中證實(shí)，MSCs可通過下調(diào)CCL3、CCL8和CCL17等炎癥趨化因子的表達(dá)，來緩解炎癥反應(yīng)， 但是其作用機(jī)制以及MSCs在這一過程中產(chǎn)生的生理變化尚未闡明。目前大多數(shù)研究只證實(shí)CCL3通過其強(qiáng)大的趨化作用介導(dǎo)MSCs到達(dá)炎癥局部發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但是我們并不清楚在這一過程中MSCs的相關(guān)分泌功能發(fā)生了什么變化。Ti等[9]研究表明， 在炎癥病理環(huán)境中，MSCs外泌體的分泌量會增加；同時相關(guān)體外研究證實(shí)， 利用干擾素γ模擬炎癥環(huán)境，MSCs外泌體分泌量會增加[10]。因此我們推測，趨化因子CCL3可能也能促進(jìn)hBMSCs外泌體的分泌。但是我們的研究證實(shí)，CCL3在促進(jìn)hBMSCs增殖的同時抑制其分泌外泌體。出現(xiàn)上述差異的原因可能在于:(1)既往外泌體的定量檢測常采用BCA方法進(jìn)行，BCA測量的是上清液中細(xì)胞分泌的所有囊泡，包括細(xì)胞直徑在100～1 000 nm的微囊泡和細(xì)胞直徑在30～100 nm的外泌體；微囊泡是細(xì)胞激活、損傷或凋亡后從細(xì)胞膜脫落的小囊泡，是真正意義上的“細(xì)胞垃圾”；因此采用BCA來進(jìn)行外泌體定量，由于不能排除大顆粒微囊泡的干擾作用，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在較大誤差。本實(shí)驗(yàn)采用目前進(jìn)行外泌體定量的2種最準(zhǔn)確方法：流式細(xì)胞術(shù)和NTA，對所收集的外泌體進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，排除了大顆粒囊泡對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CCL3雖然抑制了hBMSCs外泌體的分泌，但是卻使大顆粒微囊泡的分泌量增加，這種無效囊泡的增加勢必會影響B(tài)CA粗測的結(jié)果。(2)炎癥環(huán)境中存在著許多炎癥因子，這些炎癥因子之間相互作用會形成網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，不同的炎癥因子對MSCs外泌體分泌的調(diào)控作用可能存在差異。 因此勢必會出現(xiàn)單一影響因素(如干擾素γ和CCL3)的檢測結(jié)果與眾多因素共同作用的結(jié)果不同。

Figure 6. Flow cytometry analysis of exosome secretion in hBMSCs. The proportion of CD9+exosomes with or without CCL3 at 2 different concentrations was determined. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μg/L group.

圖6流式細(xì)胞術(shù)檢測外泌體的分泌量

表1不同濃度CCL3作用下hBMSCs外泌體粒徑分布及濃度的檢測結(jié)果

Table 1. Size and particle concentrations of the exosomes in hBMSCs with or without CCL3 treatment at different concentrations (Mean±SD.n=3)

CCL3(μg/L)Size(nm)Totalconcentration(×1010particles/mL)089．8±44．15．00±0．0610228．2±150．1?4．28±0．07?20310．9±167．4?3．58±0．07?

*P<0.05vs0 μg/L group.

Figure 7. CCL3 affected size distribution of exosomes. Nanoparticle tracking analysis (NTA) of hBMSCs exosomes was performed.

圖7NTA檢測CCL3時外泌體粒徑分布的影響

Figure 8. CCL3 stimulated the secretion of nonfunctional microvesicles (diameter >100 nm). Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg/L group.

圖8CCL3刺激hBMSCs分泌無效囊泡

目前， 外泌體的分泌機(jī)制尚未明確，現(xiàn)階段關(guān)于分泌機(jī)制的研究聚焦于相關(guān)膜蛋白的表達(dá)，例如Hyenne等[15]最新發(fā)現(xiàn)膜蛋白RAL-1參與調(diào)控外泌體的形成。關(guān)于細(xì)胞因子對于外泌體分泌的調(diào)控研究，尚未見較多報道。我們的研究證實(shí)了趨化因子CCL3可下調(diào)hBMSCs外泌體的表達(dá)，這為外泌體的分泌機(jī)制研究提供了一種新思路。

最新研究提示， hBMSCs來源的外泌體也可以預(yù)防及治療移植物抗宿主病并促進(jìn)造血微環(huán)境重建[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)， MSCs的旁分泌調(diào)節(jié)作用主要通過細(xì)胞分泌的外泌體來實(shí)現(xiàn)[8]。本實(shí)驗(yàn)通過多種方法證實(shí)，與對照組相比，CCL3作用后hBMSCs外泌體的分泌量顯著降低。這說明CCL3通過某種途徑下調(diào)了hBMSCs外泌體的分泌。因此， 我們認(rèn)為CCL3可通過減少外泌體分泌量這一方式來減弱MSCs旁分泌調(diào)節(jié)作用。此外，Ou等[17]證實(shí)， 在再生障礙性貧血環(huán)境中CCL3表達(dá)量顯著增加。再生障礙性貧血來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有較低的自我更新以及定向分化能力，并且其免疫調(diào)控能力也存在缺陷，但具體機(jī)制尚未闡明[18]。同時已有研究證實(shí)， CCL3結(jié)合CCR1后主要通過CCR1-p38途徑進(jìn)行造血負(fù)調(diào)控[19]。因此， 高分泌的CCL3對造血功能的抑制以及對MSCs外泌體分泌的抑制， 可能是再生障礙性貧血的發(fā)病機(jī)理之一。

CCL3在生物體內(nèi)的特異性受體有CCR1、CCR5和CCR9。3種受體在細(xì)胞表面分布存在差異，參與的免疫調(diào)控作用也不同。研究表明，CCR1可表達(dá)于各類免疫細(xì)胞表面，對免疫細(xì)胞到達(dá)炎癥部位產(chǎn)生募集效應(yīng), 最新研究證實(shí)CCL3與造血干細(xì)胞表面CCR1特異性結(jié)合后可抑制造血干細(xì)胞分化，特別表現(xiàn)在抑制紅系細(xì)胞的發(fā)育[19]；CCR5是白細(xì)胞的一種參與免疫調(diào)節(jié)作用的表面蛋白，在T細(xì)胞免疫中起著重要作用， HIV通過特異性識別CCR5來侵襲T細(xì)胞，造成細(xì)胞免疫功能缺陷[20], 最新研究證實(shí)CCL3與CCR5特異性結(jié)合后可通過誘導(dǎo)炎癥和血管生成以及嗜酸性粒細(xì)胞募集等效應(yīng)導(dǎo)致口腔癌的發(fā)生[21]；CCR9多表達(dá)于小腸和結(jié)腸的T淋巴細(xì)胞表面，常與特異性配體CCL25結(jié)合參與胃腸道免疫功能調(diào)控[22]。目前尚無研究證實(shí)CCL3可與hBMSCs表面某個受體特異性結(jié)合，同時也沒有關(guān)于hBMSCs膜表面上述3種受體表達(dá)情況的研究，因此我們實(shí)驗(yàn)中檢測了3種受體在hBMSCs的表達(dá)情況以及CCL3誘導(dǎo)后受體的表達(dá)差異。我們的研究證實(shí)，hBMSCs細(xì)胞膜表面存在CCR1、CCR5和CCR9這3種表面蛋白，CCL3作用hBMSCs后CCR9的表達(dá)量明顯增大，CCR1和CCR5 的表達(dá)量無顯著差異，說明CCL3可誘導(dǎo)hBMSCs膜表面CCR9表達(dá)。因此我們推測CCL3可能主要通過與CCR9特異性結(jié)合來參與對hBMSCs分泌外泌體的調(diào)控，相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究通過多種方法證實(shí)了CCL3可促進(jìn)hBMSCs增殖并抑制其分泌外泌體，說明外泌體的分泌機(jī)制不但與相關(guān)跨膜蛋白的表達(dá)相關(guān)，也與環(huán)境中的各種細(xì)胞因子有關(guān)，進(jìn)一步說明了其分泌機(jī)制的復(fù)雜性。同時， CCL3通過下調(diào)外泌體分泌量這一方式來減弱MSCs旁分泌調(diào)節(jié)作用以及其表現(xiàn)出的造血負(fù)調(diào)控作用，為再生障礙性貧血的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路。

致謝: 感謝廣東省賽萊拉干細(xì)胞研究院和廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心無償為本研究提供了所有實(shí)驗(yàn)所需間充質(zhì)干細(xì)胞。

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