沉默PARP-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7順鉑耐藥的影響*

李金霞， 馬 力

(1邢臺(tái)市人民醫(yī)院產(chǎn)科， 河北 邢臺(tái) 054000； 2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心， 河北省乳腺疾病診治中心， 河北 石家莊 050011)

乳腺癌是一種乳腺上皮組織惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著婦女的身心健康。近年來，隨著人們對(duì)腫瘤研究的深入及分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，關(guān)于腫瘤的治療方式及治療理念都出現(xiàn)了轉(zhuǎn)變。目前，針對(duì)乳腺癌的治療手段主要有放化療、手術(shù)治療及靶向分子療法，其中化療在術(shù)前及術(shù)后均起著不可替代的作用，但臨床治療中腫瘤細(xì)胞耐藥性的出現(xiàn)，大大降低了藥物的療效并可能導(dǎo)致治療失敗[1-3]。因此，探討乳腺癌耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制，尋找逆轉(zhuǎn)耐藥性的潛在靶點(diǎn)及逆轉(zhuǎn)策略，對(duì)于提高臨床療效具有重要的意義。

腫瘤細(xì)胞的耐藥性以獲得性耐藥為主，且多會(huì)對(duì)作用機(jī)制相異的其它類抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥[4]。腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥的產(chǎn)生機(jī)制比較復(fù)雜，經(jīng)常表現(xiàn)為多種機(jī)制聯(lián)合作用。這些機(jī)制主要包括：膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[如P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)及多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)等]的高表達(dá)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低；DNA損傷修復(fù)能力加強(qiáng)；酶系統(tǒng)，如谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase，GST)及細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)超家族等的異常表達(dá)；激素受體的減少；藥物靶點(diǎn)的改變及細(xì)胞凋亡受到抑制[5-10]等。

多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose) polymerase-1，PARP-1]是PARP家族的重要成員，該家族有蛋白修飾和核苷酸聚合作用，是一類DNA修復(fù)酶，在機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激和DNA損傷等情況時(shí)，PARP可通過識(shí)別斷裂的DNA片段而被激活[11-12]。有研究顯示，PARP-1的異常表達(dá)及基因多態(tài)性與多種腫瘤的發(fā)病有著密切的聯(lián)系[12-14]；此外還有研究表明，PARP-1的異常表達(dá)在腫瘤的化療耐藥中起著重要的作用[15-16]。Li等[17]的研究提示，下調(diào)PARP-1的活性可抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號(hào)通路，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，參與影響骨肉瘤U2OS細(xì)胞的耐藥性；而Mishra等[18]的研究則表示，姜黃素可通過清除PARP-1促進(jìn)急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞的凋亡。但是PARP-1在乳腺癌細(xì)胞化療耐藥中的作用及相關(guān)機(jī)制目前并沒有明確的闡釋。本文通過小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)下調(diào)乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/DDP中PARP-1的表達(dá)，研究PARP-1在乳腺癌細(xì)胞化療耐藥中的作用及其相關(guān)作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料與試劑

乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/DDP購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM培養(yǎng)基及Opti-NEM培養(yǎng)基均購(gòu)于Gibco；PARP-1 siRNA、陰性對(duì)照siRNA及SYBR Green I Real-Time PCR Kit由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供； Lipofectamine 2000及相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑由Invitrogen提供；抗PARP-1、Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyto-C)、p-ERK、ERK及 β-actin 單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz；CCK-8細(xì)胞活力分析試劑盒購(gòu)于Sigma；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；順鉑(cisplatin，Cis)購(gòu)于齊魯制藥公司；紫杉醇(paclitaxel，PTX)購(gòu)于海南海藥股份有限公司；ERK特異性抑制劑U0126購(gòu)于Cell Signaling；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)市售分析純。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。每2 d換液1次，每3～5 d用0.25%的胰酶消化、傳代。siRNA的轉(zhuǎn)染：首先取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中(接種密度為1×108/L)，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。組別設(shè)置為空白對(duì)照(blank control，control)組、陰性對(duì)照siRNA(negative control siRNA，Neg)組和PARP-1 siRNA(siRNA)組。將siRNA溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，標(biāo)記為A液；另取Lipofectamine 2000，溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，標(biāo)記為B液；輕柔混合A液和B液，室溫靜置25 min，形成復(fù)合體。將復(fù)合體加入相應(yīng)組別的細(xì)胞中，室溫孵育6 h后更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。PARP-1 siRNA的序列為 5’-AAGATAGAGCGTGAAGGCGAA-3’；陰性對(duì)照siRNA的序列為 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

2.2Real-time PCR檢測(cè)PARP-1的mRNA表達(dá) 參照操作手冊(cè)采用Trizol一步法抽提細(xì)胞總RNA。取2 μg總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA(反應(yīng)終體積為20 μL)，采用SYBR Green real-time PCR方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)。PARP-1的正向引物為5’-GCCCTAAAGGCTCAGAACGAC-3’，反向引物為5’- CACCATGCCATCAGCTACTCG-3’； β-actin作為內(nèi)參照，正向引物為5’-TGGACATCCGCAAAGAC-3’，反向引物為5’-GAAAGGGTGTAACGCAACTA-3’。PCR反應(yīng)體系包括2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μL SYBR Green PCR Master Mix和500 nmol/L正、反向引物。采用MyiQ單色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.3細(xì)胞化療藥物敏感性的檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)化療藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板中(接種密度為1×108/L)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)更換為無血清培養(yǎng)基同步化12 h，然后分別加入終濃度為0、0.01、0.1、1、10和100 μmol/L的Cis或PTX，繼續(xù)培養(yǎng)46 h，加入100 μL 的CCK-8試劑孵育2 h，經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)，計(jì)算相應(yīng)藥物的IC50。

2.4細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 用流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V/PI 雙染色法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，將各組細(xì)胞消化后，1 000×g離心收集細(xì)胞，加入Binding Buffer 重懸細(xì)胞。而后向細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC混勻，室溫避光靜置10 min；然后加碘化丙啶(propi-dium iodide，PI)染液，室溫下避光染色10 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm。

2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞的蛋白樣品，并用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整各組蛋白上樣量(80 μg)后加入4倍體積的Loading Buffer，98 ℃水浴變性5 min。微量移液器上樣后采用8% SDS-PAGE，待藍(lán)色的Loading Buffer泳出分離膠后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜(約90 min)，加入5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，依據(jù)說明書加入相應(yīng)比例的 I 抗，4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后TBST洗滌3次，每次5 min；分別加入相應(yīng)的抗HRP標(biāo)記的 II 抗，室溫孵育120 min，TBST洗滌3次，每次10 min。于暗室中將PVDF膜的蛋白面浸入HRP-ECL發(fā)光液中激發(fā)熒光，壓X片、顯影并定影。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用ImageJ 灰度分析軟件進(jìn)行蛋白半定量分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0標(biāo)準(zhǔn)版統(tǒng)計(jì)軟件包行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1PARP-1的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞MCF-7化療耐藥之間的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)了化療藥物對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/DDP及其對(duì)照親本細(xì)胞株MCF-7的IC50，結(jié)果表明，MCF-7/DDP對(duì)2種不同化療藥物的耐藥性顯著強(qiáng)于其親本細(xì)胞株(P<0.05)，見表1。同時(shí)real-time PCR及Western blot的結(jié)果顯示，MCF-7/DDP中PARP-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯高于其親本細(xì)胞株(P<0.05)；在MCF-7細(xì)胞中加入不同濃度的順鉑后，PARP-1的蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示PARP-1的表達(dá)可能與乳腺癌細(xì)胞MCF-7順鉑耐藥之間存在相關(guān)關(guān)系，見圖1。

表1乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性

Table 1. Drug sensitivity of the breast cancer cells (μmol/L. Mean±SD.n=6)

CellsIC50ofcisplatinIC50ofpaclitaxelMCF?7/DDP89．57±5．24?1．93±0．62?MCF?717．28±2．790．46±0．21

*P<0.05vsMCF-7 cells.

2轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

用real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PARP-1 siRNA在乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/DDP及其對(duì)照親本細(xì)胞株MCF-7中的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PARP-1 siRNA后，MCF-7/DDP及MCF-7細(xì)胞中PARP-1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，見圖2。

3沉默PARP-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7/DDP及MCF-7化療敏感性的影響

為進(jìn)一步證明PARP-1的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞MCF-7對(duì)順鉑耐藥之間的相互關(guān)系，我們?cè)谀退幖?xì)胞株MCF-7/DDP及其對(duì)照親本細(xì)胞株MCF-7中沉默PARP-1，并檢測(cè)其對(duì)化療藥物的敏感性。CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，沉默MCF-7/DDP細(xì)胞的PARP-1表達(dá)后，細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在MCF-7細(xì)胞中沉默PARP-1同樣可增加細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，見表2。

4沉默PARP-1對(duì)耐藥細(xì)胞株MCF-7/DDP凋亡的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MCF-7/DDP細(xì)胞中沉默PARP-1的表達(dá)之后，早期凋亡率升高(P<0.05)；而中晚期細(xì)胞凋亡/細(xì)胞壞死率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。這表明沉默PARP-1的表達(dá)可明顯促進(jìn)耐藥細(xì)胞MCF-7/DDP的凋亡。

5沉默PARP-1對(duì)凋亡信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白水平的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果顯示，沉默耐藥細(xì)胞MCF-7/DDP中PARP-1的表達(dá)之后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著下降，而凋亡蛋白Bax和激活型caspase-3的蛋白水平明顯增加；此外，Cyto-C的檢測(cè)結(jié)果示，線粒體中Cyto-C的含量顯著降低，胞漿中Cyto-C顯著升高，說明Cyto-C釋放增加，提示線粒體凋亡信號(hào)通路被激活，見圖4。

Figure 1. The relationship between PARP-1 expression and drug-resistance in MCF-7 breast cancer cells. A: the mRNA expression level of PARP-1 in MCF-7 cells and MCF-7/DDP cells； B: the protein expression level of PARP-1 in MCF-7 cells and MCF-7/DDP cells； C: the protein expression of PARP-1 was increased in MCF-7 cells treated with cisplatin (Cis). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsMCF-7 cells；#P<0.05vs0 μmol/L.

圖1PARP-1的表達(dá)與乳腺癌MCF-7細(xì)胞化療耐藥之間的關(guān)系

除此之外，我們還檢測(cè)了ERK信號(hào)通路的磷酸化情況，結(jié)果顯示，沉默耐藥細(xì)胞MCF-7/DDP中PARP-1的表達(dá)之后，p-ERK的蛋白水平顯著降低，但是對(duì)ERK總蛋白的表達(dá)沒有明顯影響，提示沉默PARP-1可抑制耐藥細(xì)胞MCF-7/DDP中ERK信號(hào)通路的磷酸化活化。且采用ERK特異性抑制劑U0126預(yù)孵MCF-7/DDP細(xì)胞可導(dǎo)致PARP-1干擾組的細(xì)胞活性進(jìn)一步降低，見圖5。

討 論

PARP-1已被證實(shí)參與細(xì)胞能量代謝，影響細(xì)胞的生存，并與腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥的出現(xiàn)密切相關(guān)[13, 15, 17]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/DDP中，PARP-1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，且在MCF-7細(xì)胞中梯度加入低濃度順鉑后，PARP-1的蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示PARP-1可能參與調(diào)控乳腺癌化療耐藥性的產(chǎn)生。此外通過轉(zhuǎn)染PARP-1 siRNA下調(diào)其表達(dá)，可提高耐藥細(xì)胞MCF-7/DDP對(duì)化療藥物的敏感性。因此我們認(rèn)為，PARP-1參與調(diào)控乳腺癌化療耐藥的出現(xiàn)。

為進(jìn)一步了解PARP-1介導(dǎo)乳腺癌化療耐藥的作用機(jī)制，我們通過沉默耐藥細(xì)胞MCF-7/DDP中PARP-1的表達(dá)，檢測(cè)PARP-1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默PARP-1可促進(jìn)MCF-7/DDP的凋亡，提示沉默PARP-1可提高乳腺癌耐藥細(xì)胞的化療敏感性可能是與促進(jìn)耐藥細(xì)胞的凋亡有關(guān)。眾所周知，細(xì)胞凋亡是一個(gè)涉及多條信號(hào)通路的復(fù)雜過程。目前認(rèn)為細(xì)胞的凋亡途徑包括死亡受體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[19]。結(jié)合PRAP-1在細(xì)胞能量代謝中的作用，我們檢測(cè)了沉默*P<0.05vssiRNA group.

Figure 2. The expression of PARP-1 in MCF-7/DDP and MCF-7 cells after transfected withPARP-1 siRNA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssiRNA group.

圖2MCF-7/DDP和MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染PARP-1siRNA后PARP-1的表達(dá)水平

表2沉默PARP-1可提高乳腺癌細(xì)胞MCF-7/DDP及MCF-7對(duì)化療藥物的敏感性

Table 2.PARP-1 knockdown increased drug sensitivity of MCF-7/DDP and MCF-7 cells (μmol/L. Mean±SD.n=6)

CellsTreatmentIC50ofcisplatinIC50ofpaclitaxelMCF?7/DDPControl89．57±5．24?1．93±0．62Neg87．61±6．13?2．02±0．59siRNA54．19±5．111．04±0．47MCF?7Control17．28±2．79?0．46±0．21Neg15．34±2．51?0．45±0．24siRNA10．07±1．820．37±0．18

PARP-1對(duì)線粒體凋亡信號(hào)通路的影響，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，PARP-1沉默可促進(jìn)耐藥細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)；同時(shí)促進(jìn)線粒體Cyto-C的釋放，激活caspase家族中的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白caspase-3。結(jié)果表明，沉默PARP-1可激活線粒體凋亡信號(hào)通路，這可能是沉默PARP-1促凋亡作用的機(jī)制之一。ERK信號(hào)通路可通過磷酸化過程激活細(xì)胞內(nèi)多種酶和信號(hào)分子，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程[20-21]。聯(lián)系到PARP-1對(duì)ERK信號(hào)通路的影響[17, 22]，我們進(jìn)一步檢測(cè)了沉默PARP-1對(duì)MCF-7/DDP細(xì)胞中ERK信號(hào)通路的影響，結(jié)果表明沉默PARP-1可抑制耐藥細(xì)胞MCF-7/DDP中ERK信號(hào)通路的磷酸化活化；且采用ERK特異性抑制劑U0126預(yù)孵MCF-7/DDP細(xì)胞可導(dǎo)致PARP-1干擾組的細(xì)胞活性進(jìn)一步降低。但是其具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入的研究。

Figure 3. The effect ofPARP-1 knockdown on MCF-7/DDP cell apoptosis analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssiRNA group.

圖3沉默PARP-1對(duì)MCF-7/DDP細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4. The effect ofPARP-1 knockdown on mitochondrial apoptosis pathway in MCF-7/DDP cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssiRNA group.

圖4沉默PARP-1對(duì)MCF-7/DDP細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)通路的影響

Figure 5. The effect ofPARP-1 knockdown on the activation of ERK. A: the expression of p-ERK and ERK in MCF-7/DDP cells after transfected withPARP-1 siRNA； B: the effect of U0126 incubation on cell viability. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssiRNA group.

圖5沉默PARP-1對(duì)MCF-7/DDP細(xì)胞ERK活性的影響

綜上所述，乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞MCF-7/DDP中沉默PARP-1可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，并促進(jìn)細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑凋亡，其機(jī)制可能與抑制ERK信號(hào)通路的磷酸化有關(guān)。

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