雞場(chǎng)空氣及糞便中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的分布特征與影響因素

韓 帥 ，孫興濱 ，陳 默 ，高 敏 ，王旭明

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100193）

金黃色葡萄球菌是一種重要的人畜共患條件致病菌。在臨床上可引起人類皮膚組織感染、敗血癥、肺炎、腸炎、腦膜炎和中毒性休克綜合征等疾病[1]。在動(dòng)物養(yǎng)殖中可引起家畜乳房炎[2]、禽類關(guān)節(jié)炎[3]、外傷化膿性炎癥、泌尿道感染[4]等多種疾病。嚴(yán)重侵害家畜健康，使畜牧業(yè)遭受重大經(jīng)濟(jì)損失[5]。1961年，英國(guó)的Jevons[6]發(fā)現(xiàn)了第一株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）。MRSA含有mecA及其相關(guān)基因[7]，幾乎對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類抗生素具有耐藥性[8-9]，被稱為“超級(jí)細(xì)菌”[10]。目前對(duì)感染MRSA的治療已經(jīng)成為最棘手的問(wèn)題[11]。MRSA不僅可以感染人類，而且也是家畜感染的重要致病菌[12-13]。近年來(lái)，由于抗生素藥物在養(yǎng)殖業(yè)的不規(guī)范使用，導(dǎo)致動(dòng)物感染MRSA的事件逐年增加[14]。

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展和人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，以集約化、工廠化為主要養(yǎng)殖模式的現(xiàn)代化畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)量不斷增加[15]。其中，蛋雞數(shù)量已占全球的40%[16]。在高密度的養(yǎng)殖條件下，墊料、動(dòng)物自身以及糞便中含有的包括病原菌或條件致病菌在內(nèi)的微生物，通過(guò)風(fēng)化、腐蝕、空氣氣流彌散等作用懸浮在空氣中形成生物氣溶膠[17]，引起動(dòng)物或飼養(yǎng)員的感染[18]。這些微生物還可以負(fù)載到顆粒物表面，傳播到舍外環(huán)境[19]，導(dǎo)致氣源性傳染病流行[20]，給附近居民健康帶來(lái)極大威脅[21-22]。其中，動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑小于2.5 μm的顆粒（PM2.5）可直接深入到細(xì)支氣管和肺泡，從而增加人和動(dòng)物的發(fā)病率和死亡率[23]。因此，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注顆粒物特別是細(xì)顆粒物負(fù)載的空氣微生物[24-25]。

自首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，MRSA已成為爆發(fā)率最高的醫(yī)院內(nèi)感染病原菌之一，分離率可達(dá)55.73%[26]。動(dòng)物中最先在患乳房炎的奶牛中發(fā)現(xiàn)MRSA[27]，之后相繼在豬、牛、羊和雞等動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)[28]。在歐洲地區(qū)的家禽、豬和牛肉類制品中MRSA的檢出率達(dá)到27.3%、10.4%和9.6%[29]。目前有關(guān)MRSA的研究多集中在人醫(yī)環(huán)境[30-31]和部分豬、牛、羊養(yǎng)殖環(huán)境[32-34]中的定殖情況、傳播擴(kuò)散與耐藥機(jī)制。而對(duì)于家禽空氣環(huán)境中的MRSA研究相對(duì)較少，尤其是細(xì)顆粒物負(fù)載MRSA以及其影響因素均未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)對(duì)北京地區(qū)一家蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行等時(shí)間間隔連續(xù)采樣，記錄養(yǎng)殖環(huán)境中MRSA的濃度變化，分析其影響因素。

1 材料與方法

1.1 采樣時(shí)間和地點(diǎn)

本研究在2016年7—11月期間，對(duì)北京平谷地區(qū)一家規(guī)?；半u養(yǎng)雞場(chǎng)兩棟雞舍分別進(jìn)行同時(shí)采樣調(diào)查。雞場(chǎng)所處位置地勢(shì)平坦，其800 m輻射半徑內(nèi)不受較高建筑物及公路主干道影響。采樣當(dāng)日天氣均為晴天。主要采集空氣樣本和相應(yīng)糞便樣本。兩棟雞舍飼養(yǎng)品種均為海蘭蛋雞，所處環(huán)境及養(yǎng)殖方式相同，采取籠上養(yǎng)殖，每個(gè)雞舍內(nèi)蛋雞數(shù)量均在9300只左右，雞舍采取機(jī)械通風(fēng)，每周帶雞消毒2次。

1.2 采樣方法和培養(yǎng)方法

生物氣溶膠采集在清糞、噴淋消毒等作業(yè)開(kāi)始前40 min完成。采集使用FA-Ⅰ撞擊式采樣器（遼陽(yáng)，中國(guó)）。該儀器將空氣中的帶菌粒子按空氣動(dòng)力學(xué)直徑大小分別捕捉在各級(jí)培養(yǎng)皿上，具體粒徑分布信息如表1所示。采樣高度距地面1.5 m，細(xì)菌與抗生素耐藥菌樣本采集時(shí)間經(jīng)優(yōu)化，分別為1 min和2 min，氣體流量28.3 L·min-1，每次采樣前用流量計(jì)（余姚，中國(guó)）對(duì)采樣泵進(jìn)行流量校正，每個(gè)采樣點(diǎn)同時(shí)采集3個(gè)平行樣本。采用相同方式檢測(cè)舍內(nèi)溫度、相對(duì)濕度和各粒徑顆粒物濃度，使用溫濕度計(jì)檢測(cè)（WD-35612，OAKTON，德國(guó)）。

1.2.1 雞舍內(nèi)空氣中細(xì)菌及耐藥菌的培養(yǎng)

樣本采集選用9 cm培養(yǎng)皿，滅菌后加入20 mL培養(yǎng)基。細(xì)菌采用LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2 d。金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均采用CHRMagar顯色培養(yǎng)基（法國(guó)科瑪嘉公司），37℃培養(yǎng)24 h，均選取培養(yǎng)基上呈紅色、紅褐色或粉紅色的邊緣光滑菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)[35-36]。采集樣本在進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時(shí)，采用Positive hole method方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)校正。取同一采樣點(diǎn)3次計(jì)數(shù)校正后平均值計(jì)算出平均細(xì)菌濃度（CFU·m-3）。

表1 FA-Ⅰ撞擊式采樣器特征Table 1 FA-ⅠImpingement sampler characteristics

1.2.2 糞便中細(xì)菌及耐藥菌的培養(yǎng)

收集與空氣樣本對(duì)應(yīng)的新鮮糞便樣本，采用五點(diǎn)法，將5個(gè)點(diǎn)采集的新鮮糞便混合均勻作為一個(gè)樣本，冷藏運(yùn)輸。為使得糞便中細(xì)菌具有良好活性，取10 g糞便加0.8%滅菌生理鹽水100 mL，37℃、160 r·min-1，搖菌12~16 h。得到的菌液取1 mL加入裝有9 mL 滅菌生理鹽水的離心管中，按 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍比稀釋，選取 10-5、10-6、10-7梯度菌液各100 μL用涂布棒均勻涂布在LB培養(yǎng)基上，每稀釋梯度涂布3塊培養(yǎng)皿，28℃培養(yǎng)2 d。選取10-3、10-4、10-5梯度菌液各100 μL用涂布棒均勻涂布于CHRMagar顯色培養(yǎng)基上，每稀釋梯度涂布3塊培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)24 h。在進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時(shí)，選取各重復(fù)菌落計(jì)數(shù)相近且菌落計(jì)數(shù)在30~300個(gè)的稀釋梯度平板為宜。采用Positiveholemethod方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)校正。取同一稀釋梯度3次計(jì)數(shù)校正后平均值計(jì)算出平均細(xì)菌濃度（CFU·g-1）。

1.3 計(jì)算方法

1.3.1 空氣中細(xì)菌氣溶膠濃度

根據(jù)采樣時(shí)間和氣體流量，利用公式（1）計(jì)算各級(jí)生物氣溶膠濃度。

式中：Ca為細(xì)菌或耐藥菌氣溶膠濃度，CFU·m-3；N 為各級(jí)菌落數(shù)，CFU；t為采樣時(shí)間，min；F為采樣時(shí)的氣體流量，L·min-1。

1.3.2 糞便中細(xì)菌濃度

根據(jù)稀釋梯度和樣品質(zhì)量，利用公式（2）計(jì)算糞便中細(xì)菌濃度。

式中：Cf為糞便中細(xì)菌或耐藥菌濃度，CFU·g-1；N 為各稀釋梯度菌落數(shù)，CFU；a為稀釋倍數(shù)；10為實(shí)驗(yàn)樣本質(zhì)量，g。

1.3.3 耐藥菌占總細(xì)菌濃度比例

式中：η為耐藥菌所占比例；C為細(xì)菌或耐藥菌濃度，CFU·m-3。

1.3.4 細(xì)顆粒物中耐藥菌氣溶膠所占比例

本研究將粒徑 D50≤2.1 μm（stageⅣ）定義為細(xì)顆粒物。細(xì)顆粒物所負(fù)載耐藥菌氣溶膠比例（FBT）計(jì)算公式如下：

式中：BⅠ、BⅡ、BⅢ、BⅣ、BⅤ、BⅥ分別為分布在 StageⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ粒徑范圍內(nèi)耐藥菌氣溶膠濃度，CFU·m-3。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。當(dāng)P<0.05時(shí)，表明在95%置信區(qū)間內(nèi)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異；當(dāng)P<0.01時(shí)，表明在99%置信區(qū)間內(nèi)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。運(yùn)用逐步回歸方法，建立雞舍空氣及糞便中與MRSA濃度相關(guān)影響因素的回歸方程，R趨近于1表明此回歸效果較好。

2 結(jié)果與討論

2.1 雞舍空氣中MRSA特點(diǎn)

2.1.1 雞舍空氣中MRSA濃度及比例

本研究采集了蛋雞舍內(nèi)環(huán)境中總細(xì)菌（LB）、金黃色葡萄球菌（S）和MRSA氣溶膠樣本，并進(jìn)行微生物培養(yǎng)和計(jì)數(shù)，對(duì)比分析上述細(xì)菌生物氣溶膠濃度和比例隨蛋雞日齡的變化趨勢(shì)，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在蛋雞日齡分別為145、404 d檢出舍內(nèi)環(huán)境總細(xì)菌氣溶膠濃度最低值和最高值，即總細(xì)菌氣溶膠濃度變化范圍在 1.9×103~3.8×104CFU·m-3。整體來(lái)看，總細(xì)菌氣溶膠濃度隨日齡增加呈上升趨勢(shì)。其中，日齡分別為209、270、378 d所檢測(cè)到的總細(xì)菌氣溶膠濃度相比臨近日齡濃度略有下降，但濃度差異小于1個(gè)數(shù)量級(jí)。本研究中所檢測(cè)到的總細(xì)菌氣溶膠濃度略低于萊蕪市蛋雞舍內(nèi)濃度[21]，相比山西地區(qū)某牛場(chǎng)（2.1×102~5.26×103CFU·m-3）和羊場(chǎng)（3.7×102~5.55×103CFU·m-3）中空氣細(xì)菌濃度略高[37]。值得關(guān)注的是，在較大日齡343 d和404 d所檢測(cè)到的總細(xì)菌濃度高于我國(guó)《畜禽場(chǎng)環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的細(xì)菌濃度界定值（2.5×104CFU·m-3）。金黃色葡萄球菌濃度的最低和最高值分別在日齡145 d和343 d檢出，濃度分別為 2.8×102CFU·m-3和 2.19×103CFU·m-3，整體變化趨勢(shì)與總細(xì)菌相似。該濃度變化范圍與山西某牛場(chǎng)和羊場(chǎng)以及山東泰安市某雞舍內(nèi)檢測(cè)到的濃度范圍相近[37-38]。其中，在日齡分別為209、270 d和404 d所檢測(cè)到的金黃色葡萄球菌濃度略有下降。據(jù)既往研究，養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌會(huì)負(fù)載到細(xì)顆粒物（動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑≤2.5 μm），通過(guò)空氣途徑傳播[19]。本研究檢測(cè)到的金黃色葡萄球菌濃度變化可能是受到雞舍內(nèi)細(xì)顆粒物濃度變化的影響。在上述3個(gè)日齡下檢測(cè)到的PM2.5濃度較前一日齡相比濃度均有下降，分別為6.93、2.77 μg·m-3和 4.23 μg·m-3。MRSA 濃度的檢測(cè)結(jié)果顯示，整體上，MRSA的平均值為（4.31×102±4.56×102）CFU·m-3，在 145~176 d，其濃度隨日齡增加有升高趨勢(shì)。在176~270 d，MRSA濃度由4.7×102CFU·m-3逐步下降到 80 CFU·m-3，310 d 濃度上升到最高值 1.15×103CFU·m-3，后逐步下降，404 d 檢測(cè)到最低值 70 CFU·m-3。

圖1 雞舍內(nèi)部空氣中MRSA、金黃色葡萄球菌（S）和總細(xì)菌（LB）濃度及比值Figure 1 Concentrations and percentages of MRSA,Staphylococcus aureus（S）and total bacteria（LB）in air of layer house

由圖1可知，與MRSA濃度變化趨勢(shì)相似，在176~270 d，MRSA/LB由最高值5.47%下降到0.76%，310~343 d，MRSA/LB由1.84%上升到3.22%后逐步下降，404 d檢測(cè)到最低值0.21%。在所檢測(cè)的259 d中，MRSA/LB的均值為2.04%±1.72%。該值略低于已有研究對(duì)山東兩個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)檢出具有耐甲氧西林抗性基因的金黃色葡萄球菌比例（4.2%和8.3%）[39]。MRSA/S比值在14%~95%之間，均值為41.99%±26.99%，該比率變化可能受到舍內(nèi)溫度的影響。在MRSA/S最高比例的第310 d，溫度檢測(cè)到最高值為29℃，當(dāng)378 d溫度為17℃時(shí)，檢測(cè)到MRSA/S的最低值。S/LB變化趨勢(shì)與MRSA/LB相似，在145 d和404 d檢測(cè)到最高值與最低值，分別為14.4%和0.66%，均值為4.91%±5.89%。本階段研究結(jié)果表明，MRSA/LB和MRSA/S的比值變化可能受到MRSA濃度及舍內(nèi)溫度的影響。在雞舍環(huán)境中雖檢測(cè)到金黃色葡萄球菌和MRSA，但二者占總細(xì)菌濃度比例較低。而在檢測(cè)到的金黃色葡萄球菌中具有耐甲氧西林抗性的細(xì)菌平均比例高達(dá)41.99%，這一結(jié)果與以往研究對(duì)廣東地區(qū)飼養(yǎng)場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、肉類市場(chǎng)3種空氣環(huán)境的研究（48.2%）結(jié)果相似[40]，低于醫(yī)院環(huán)境中的MRSA檢出率（55.6%和 57.1%）[26，31]。

2.1.2 細(xì)顆粒物表面負(fù)載MRSA比例

據(jù)流行病學(xué)研究，長(zhǎng)期暴露在細(xì)顆粒物（動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑小于2.5 μm的顆粒）污染的環(huán)境中，可增加人和動(dòng)物的發(fā)病率和死亡率[25]。因此，本研究對(duì)PM2.5所負(fù)載的MRSA濃度及比例進(jìn)行計(jì)算分析，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，PM2.5負(fù)載的MRSA濃度的變化規(guī)律與空氣中總的MRSA濃度相似，其濃度范圍在26~441 CFU·m-3之間，均值為（151±170）CFU·m-3。其中，PM2.5負(fù)載濃度的最高值與最低值檢出日齡和MRSA濃度臨界值檢出日齡相同，分別在343 d和404 d。PM2.5負(fù)載MRSA比例變化范圍11%~75%，均值為38.13%±20.17%，其中在日齡 244、270、343 d和 404 d的負(fù)載比例均高于40%，該負(fù)載比值說(shuō)明MRSA濃度變化可能會(huì)受到細(xì)顆粒物濃度變化影響。

2.2 雞舍糞便中MRSA濃度及比例

畜禽糞便被認(rèn)為是養(yǎng)殖環(huán)境中抗性細(xì)菌存在的重要來(lái)源庫(kù)，本研究在采集氣溶膠樣品的同時(shí)收集相同日齡的糞便樣品，進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)后計(jì)算出相應(yīng)濃度，并分析雞舍糞便中總細(xì)菌、金黃色葡萄球菌及MRSA隨蛋雞日齡增長(zhǎng)的濃度及比例變化。結(jié)果如圖3所示。

如圖3可知，在蛋雞日齡增加過(guò)程中，糞便中細(xì)菌濃度雖有小幅度波動(dòng)，但整體上糞便樣品中總細(xì)菌、金黃色葡萄球菌以及MRSA的濃度均隨日齡增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。總細(xì)菌濃度的變化范圍在3.1×107~4.1×108CFU·g-1，其最高值及最低值分別在日齡343 d和145 d時(shí)檢出，其濃度變化趨勢(shì)與空氣中總細(xì)菌濃度變化一致，說(shuō)明糞便可能是雞舍內(nèi)空氣中細(xì)菌主要來(lái)源。柳敦江[39]對(duì)泰安養(yǎng)雞場(chǎng)舍內(nèi)金黃色葡萄球菌的研究也得到了相似結(jié)論。259 d的檢測(cè)結(jié)果顯示，糞便中金黃色葡萄球菌濃度變化范圍在1.6×104~2.3×105CFU·g-1，其最高值及最低值分別在404 d和176 d檢出。其中MRSA濃度的最低值和最高值在同一天檢測(cè)出，分別為 3×103CFU·g-1和 1.31×105CFU·g-1，其濃度平均值為（3.37×104±4.83×104）CFU·g-1。

圖2 雞舍空氣中PM2.5負(fù)載MRSA濃度及比例Figure 2 Concentrations and percentages of MRSA on fine particles（PM2.5）in air of layer house

圖3 雞舍內(nèi)糞便中MRSA、金黃色葡萄球菌（S）和總細(xì)菌（LB）濃度及比值Figure 3 Concentrations and percentages of MRSA,Staphylococcus aureus（S）and total bacteria（LB）in faeces of layers

與MRSA濃度變化相比，MRSA/LB和MRSA/S比值變化趨勢(shì)雖波動(dòng)較大，但二者比例的最高值仍在日齡404 d檢出，分別為4.49%和57.75%。MRSA/LB比例變化范圍為0.11%~4.49%，其中在日齡244、378、404 d所檢測(cè)到比值較其他日齡高，該變化趨勢(shì)與糞便中MRSA濃度變化相符。S/LB比例變化范圍為3.72%~51.8%，MRSA/S的比例變化范圍在4.375%~57.75%。以上3種比例的均值分別為1.82%±1.81%、13.67%±15.99%、22.11%±20.06%。本研究結(jié)果顯示，蛋雞糞便中的MRSA/LB與MRSA/S的比值均低于空氣中所檢測(cè)到的相應(yīng)濃度比值，該結(jié)果可能與MRSA的存活率會(huì)受到養(yǎng)殖環(huán)境中不同介質(zhì)影響有關(guān)。

2.3 雞舍空氣中MRSA影響因素

畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌氣溶膠濃度可能會(huì)受到多種不定因素影響，其中包括溫度、濕度及各粒徑顆粒物濃度。本研究對(duì)上述所涉及到的影響因素進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖4所示。

由于樣品來(lái)源于同一家養(yǎng)雞場(chǎng)的兩棟不同日齡雞舍，溫度受采樣時(shí)季節(jié)變化的影響。由圖4可知，蛋雞日齡在145~270 d之間時(shí)，舍內(nèi)溫度由28℃逐步下降到13℃；在310~404 d之間時(shí)，舍內(nèi)溫度由最高值29℃逐步降到最低值12℃。在采樣期間，溫度的均值為（21.9±6.6）℃。濕度的變化范圍為33%~71%，與溫度變化規(guī)律相似，最高值與最低值檢出日齡分別在310 d和404 d，均值為53%±14%。PM1濃度變化范圍為 0.6~18.1 μg·m-3，均值為（6.73±6.19）μg·m-3，最高值與最低值檢出日齡在310 d和404 d，變化規(guī)律與溫度相似。PM2.5濃度變化范圍為4.2~36.5 μg·m-3，均值為（16.14±11.59）μg·m-3，臨界值檢出日齡與 PM1相同。整體來(lái)看，細(xì)顆粒物濃度變化趨勢(shì)與溫度和濕度變化趨勢(shì)保持一致。PM4濃度變化為9.2~55.6 μg·m-3，均值為（33.6±15.1）μg·m-3。PM7濃度范圍為 20.3~169.3 μg·m-3，均值為（76.9±38.6）μg·m-3。PM10濃度范圍為 54.1~332.6 μg·m-3，均值為（130.2±82.7）μg·m-3?？倯腋☆w粒物濃度變化范圍為111.6~919.8 μg·m-3，均值為（292.9±253.5）μg·m-3。其中總懸浮顆粒物與PM10顆粒物濃度均符合我國(guó)《畜禽場(chǎng)環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》。

本研究進(jìn)一步考察了雞日齡、溫度和各粒徑顆粒物濃度對(duì)雞舍內(nèi)總細(xì)菌、金黃色葡萄球菌以及MRSA的影響相關(guān)性。分析結(jié)果如表2所示。

由表2可知，空氣中總細(xì)菌濃度與糞樣中總細(xì)菌濃度呈顯著正相關(guān)（P<0.01），而糞樣中總細(xì)菌濃度與雞日齡呈顯著正相關(guān)（P<0.01）。因此，空氣中總細(xì)菌濃度隨日齡變化呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，同時(shí)說(shuō)明糞便可能是空氣中生物氣溶膠的主要來(lái)源。空氣中MRSA濃度與溫度（P<0.01）、PM1濃度（P<0.05）、金黃色萄葡球菌濃度（P<0.01）呈顯著正相關(guān)，其中PM1濃度與溫度（P<0.05）、PM2.5濃度（P<0.01）呈顯著正相關(guān)。該相關(guān)性結(jié)果表明，溫度的變化會(huì)引起細(xì)顆粒物濃度的變化，從而引起所負(fù)載的MRSA濃度變化，導(dǎo)致空氣中MRSA、金黃色萄葡球菌隨蛋雞日齡變化過(guò)程中所呈現(xiàn)的濃度變化與采樣時(shí)溫度變化相一致。值得注意的是，上述結(jié)果未發(fā)現(xiàn)空氣中MRSA與糞便中MRSA的顯著相關(guān)性，這可能和雞場(chǎng)所處地理環(huán)境和養(yǎng)殖管理方式有關(guān)，也可能由于MRSA除了分布在糞便中還可存在于雞的羽毛、皮膚和呼吸道中。空氣中MRSA/LB比值與空氣中MRSA濃度（P<0.05）呈顯著正相關(guān)，而S/LB與MRSA/LB（P<0.05）呈顯著正相關(guān)，二者比值變化趨勢(shì)與MRSA濃度變化相類似。糞樣中MRSA濃度變化與溫度（P<0.05）為顯著負(fù)相關(guān)，糞樣中MRSA/LB與MRSA（P<0.05）為顯著正相關(guān)。這可能是因?yàn)闇囟壬?，加速糞便中MRSA逸散，空氣中MRSA濃度相應(yīng)升高。這導(dǎo)致了糞樣中MRSA和MRSA/LB、MRSA/S比值有異于空氣中相應(yīng)變化。

圖4 雞舍內(nèi)溫度、濕度和顆粒物Figure 4 Temperature，humidity and concentration of particles in air of layer house

表2 雞舍空氣中MRSA影響因素Spearman相關(guān)性分析Table 2 Spearman correlation analysis of factors influencing methicillin-resistant staphylococcus aureus（MRSA）in air of layer house

本研究根據(jù)上述相關(guān)性分析結(jié)果作出初步回歸分析，以此得到影響因素與MRSA、金黃色萄葡球菌和總細(xì)菌之間的量化關(guān)系。分析結(jié)果如表3所示。

由表3可知，當(dāng)環(huán)境中其他變量保持穩(wěn)定時(shí)，雞舍內(nèi)溫度每升高1℃，空氣中MRSA濃度平均升高49 CFU·m-3（R2=0.53）。同樣條件下，日齡每增加1 d，空氣中總細(xì)菌濃度平均升高110 CFU·m-3（R2=0.63）；糞樣中總細(xì)菌濃度平均升高1.27×106CFU·m-3（R2=0.71），MRSA 濃度平均升高 434 CFU·m-3（R2=0.53），金黃色葡萄球菌濃度平均升高899 CFU·m-3（R2=0.94）。其中，糞樣總細(xì)菌濃度每升高1 CFU·m-3，空氣中總細(xì)菌濃度上升8.07×10-5CFU·m-3（R2=0.77）。

3 結(jié)論

本研究對(duì)蛋雞場(chǎng)空氣和糞便中MRSA、金黃色葡萄球菌和總細(xì)菌的濃度進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)?shù)半u在145~404 d日齡之間時(shí)，其舍內(nèi)空氣中總細(xì)菌、糞便中總細(xì)菌、MRSA和金黃色葡萄球菌濃度與日齡存在顯著正相關(guān)。雞舍空氣中MRSA濃度隨蛋雞日齡增加而增加，與雞舍內(nèi)溫度和細(xì)顆粒物呈顯著正相關(guān)。整體上，MRSA/S較S/LB和MRSA/LB比值高，且空氣中的MRSA/S比值略高于糞便中相應(yīng)比值。本研究結(jié)果將為養(yǎng)雞場(chǎng)空氣中MRSA對(duì)工人以及對(duì)環(huán)境和居民的危害評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

表3 雞舍空氣中MRSA影響因素回歸分析Table 3 Regression analysis of factors influencing MRSA in air of layer house

[1]Trautmann M,Lepper P,Schmitz F J.Three cases of bacterial meningitis after spinal and epidural anesthesia[J].European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases,2002,21（1）：43-45.

[2]Lee J H.Methicillin（oxacillin）-resistant Staphylococcus aureus strains isolated from major food animals and their potential transmission to humans[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69（11）：6489-6494.

[3]朱曉平,范國(guó)雄,程金科,等.雞葡萄球菌病發(fā)病機(jī)理的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),1990,21（2）：167-173.ZHU Xiao-ping,FAN Guo-xiong,CHENG Jin-ke,et al.Studies on the pathogenesis of Staphylococcus in chickens[J].Acta Veterinariaet Zootechnica Sinica,1990,21（2）：167-173.

[4]Lee J H,Jeong J M,Park Y H,et al.Evaluation of the methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）：Screen latex agglutination test for detection of MRSA of animal origin[J].Journal of Clinical Microbiology,2004,42（6）：2780-2782.

[5]Weese J S.Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in animals[J].Institute for Laboratory Animal Research,2010,51（3）：233-244.

[6]Jevons M P."Celbenin"-resistant Staphylococci[J].British Medical Journal,1961,1（5219）：124-125.

[7]Grundmann H,Aires-de-Sousa M,Boyce J,et al.Emergence and resurgence of meticillin-resistant Staphylococcus aureus as a public-health threat[J].The Lancet,2006,368（9538）：874-885.

[8]歐陽(yáng)應(yīng)斌,陳寧慶.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)（流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊(cè)）,1989,2（3）：49-53.OUYANG Ying-bin,CHEN Ning-qing.Progress in research on infection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].International Journal of Epidemiology and Infectious Disease,1989,2（3）：49-53

[9]Schwartz,David A.Principles and practice of infectious disease[J].Archives of Pathology&Laboratory Medicine,1997,121（8）：908.

[10]寇 芮.動(dòng)物源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性分析及分子流行病學(xué)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2010：10-11.KOU Rui.Study on antibiotic resistance analysis and molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from animals[D].Nanjing：Nanjing Agriculture University,2010：10-11.

[11]Hiramatsu K,Cui L Z,Kuroda M,et al.The emergence and evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Trends in Microbiology,2001,9（10）：486-493.

[12]裴 雙,蘇建榮.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性分析及mecA和PVL基因檢測(cè)[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2017,16（1）：94-97.PEI Shuang,SU Jian-rong．An analysis on methicillin-resistant Staphylococcusaureus andtesting for genes mecAand PVL[J]．Journal of Clinical and Experimental Medicine,2017,16（1）：94-97.

[13]Meemken D,Cuny C,Witte W,et al.Occurrence of MRSA in pigs and in humans involved in pig production：Preliminary results of a study in the Northwest of Germany[J].Dtsch Tierarztl Wochenschr,2008,115（4）：132-139.

[14]姜慧嬌,蘇 艷,韋海娜,等.牛乳源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測(cè)與耐藥性分析[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,36（1）：16-20.JIANG Hui-jiao,SU Yan,WEI Hai-na,et al.Analysis on dectection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from bovine milk and its resistance to drugs[J].Journal of Xinjiang Agricultural University,2013,36（1）：16-20.

[15]柴同杰,黃艷群.蛋雞生產(chǎn)中的健康飼養(yǎng)與動(dòng)物福利[J].中國(guó)家禽,2010,32（22）：41-44.CHAI Tong-jie,HUANG Yan-qun.Healthy feeding and animal welfare of layers production[J].China Poultry,2010,32（22）：41-44.

[16]Mekouar M A.Food and agriculture organization（FAO）[J].Yearbook of International Enviromental Law,2014,24（1）：587-602.

[17]高 敏,賈瑞志,仇天雷,等.畜禽養(yǎng)殖中逸散生物氣溶膠特征的研究進(jìn)展[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào).2015,31（1）：12-21.GAO Min,JIA Rui-zhi,QIU Tian-lei,et al.Progress in research on characteristics of bioaerosol diffused during livestock breeding[J].Journal of Ecology and Rural Environment,2015,31（1）：12-21.

[18]Fiegel J,Clarke R,Edwards D A.Airborne infectious disease and the suppression of pulmonary bioaerosols[J].Drug Discov Today,2006,11（1/2）：51-57.

[19]Mceachran A D,Blackwell B R,Hanson J D,et al.Antibiotics,bacteria,and antibiotic resistance genes：Aerial transport from cattle feed yards via particulate matter[J].Environmental Health Perspectives,2015,123（4）：337-343.

[20]段會(huì)勇,柴同杰,蔡玉梅,等.ERIC-PCR對(duì)雞舍大腸桿菌氣溶膠向舍外環(huán)境傳播的鑒定[J].中國(guó)科學(xué)（C輯：生命科學(xué)）,2008,39（1）：74-83.DUAN Hui-yong,CHAI Tong-jie,CAI Yu-mei,et al.Identification of airborne Escherichia coli from hen house spreads to surroundings using ERIC-PCR[J].Science in China（Series C：Life Sciences）,2008,39（1）：74-83.

[21]姚美玲,張 彬,柴同杰.雞兔舍耐藥大腸桿菌氣溶膠向環(huán)境擴(kuò)散的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2007,35（8）：60-64.YAO Mei-ling,ZHANG Bin,CHAI Tong-jie.Antibiotic resistance of airborne Escherichia coli from hen house and rabbitry and their spreading to surroundings[J].Journal of Northwest A&F University（Nat Sci Ed）,2007,35（8）：60-64.

[22]Pathare N A,Asogan H,Tejani S,et al.Prevalence of methicillin resistant Staphylococcus aureus[MRSA]colonization or carriage among health-care workers[J].Journal of Infection and Public Health,2016,9（5）：571-576.

[23]趙傳陽(yáng),李永安,劉學(xué)來(lái).粉塵PM2.5及其對(duì)人體的危害[J].制冷與空調(diào),2013,119（4）：403-406,419.ZHAO Chuan-yang,LI Yong-an,LIU Xue-lai.PM2.5and its impact on the health hazards[J].Refrigeration and Air Conditioning,2013,119（4）：403-406,419.

[24]高 敏,仇天雷,秦玉成,等.養(yǎng)雞場(chǎng)空氣中抗性基因和條件致病菌污染特征[J].環(huán)境科學(xué),2017,38（2）：510-516.GAO Min,QIU Tian-lei,QIN Yu-cheng,et al.Sources and pollution characteristics of antibiotic resistance genes and conditional pathogenic bacteria in concentrated poultry feeding operations[J].Environmental Science,2017,38（2）：510-516.

[25]高 敏,賈瑞志,仇天雷,等.集約化養(yǎng)雞場(chǎng)舍內(nèi)細(xì)菌氣溶膠群落結(jié)構(gòu)研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2015,34（10）：1985-1990.GAO Min,JIA Rui-zhi,QIU Tian-lei,et al.Bacterial community of bioaerosols in atmospheric environment of confined poultry feeding operations[J].Journal of Agro-Environment Science,2015,34（10）：1985-1990.

[26]李建寧,曹龍翎.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌院內(nèi)感染和耐藥性分析[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師（醫(yī)學(xué)專業(yè)）,2012,14（22）：196-197.LI Jian-ning,CAO Long-ling.Analysis on methicillin-resistant Staphylococcus aureus hospital infection and resistance to drugs[J].Chinese Community Doctors,2012,14（22）：196-197.

[27]Alt K,Fetsch A,Schroeter A,et al.Factors associated with the occurrence of MRSA CC398 in herds of fattening pigs in Germany[J].BMC Vet Res,2011,37（7）：69.

[28]劉 洋,梁耀峰,焦新安,等.中國(guó)部分地區(qū)豬源和牛源金黃色葡萄球菌耐藥性及凝固酶分型研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45（17）：3608-3616.LIU Yang,LIANG Yao-feng,JIAO Xin-an,et al.Antibiotic resistance and coagulase typing of Staphylococcus aureus isolates from pigs and cows in part of China[J].Scientia Agricultura Sinica,2012,45（17）：3608-3616.

[29]De Boer E,Zwartkruis-Nahuis J T M,Wit B,et al.Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in meat[J].International Journal of Food Microbiology,2009,134（1/2）：52-56.

[30]吳泰順,吳禮康,張 勤,等.金黃色葡萄球菌醫(yī)院感染與外環(huán)境關(guān)系的研究[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué),2004,34（5）：1-3.WU Tai-shun,WU Li-kang,ZHANG Qin,et al.Research on the correlation between the Staphylococcus aureus nosocomial infection and hospital environment[J].South China J Prev Med,2004,34（5）：1-3.

[31]陳 端,袁 惠,嚴(yán)其榮,等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的監(jiān)測(cè)（摘要）[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1993,14（4）：26.CHEN Duan,YUAN Hui,YAN Qi-rong,et al.Monitor of methicillinresistant Staphylococcus aureus[J].Journal of Kunming Medical College,1993,14（4）：26.

[32]劉敬蘭,劉繼超,姜鐵民,等.北京某牛場(chǎng)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)奶牛,2015,291（7）：39-42.LIU Jing-lan,LIU Ji-chao,JIANG Tie-min,et al.The survey and analysis of the resistant bacteria from cow mastitis in a dairy farm in Beijing[J].China Dairy Cattle,2015,291（7）：39-42.

[33]黃 仆.四川地區(qū)豬群中耐甲氧西林金黃色葡萄球的分離鑒定和耐藥性研究[D].成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2014：20-24.HUANG Pu.Study on isolation and drug resistance of Staphylococcus aureus from pigs in Sichuan Province[D].Chengdu：Sichuan Agriculture University,2014：20-24.

[34]王愛(ài)華,趙德東.羊血液中攜帶金黃色葡萄球菌的調(diào)查報(bào)告[J].職業(yè)衛(wèi)生與應(yīng)急救援,2004,22（1）：51.WANG Ai-hua,ZHAO De-dong.Research on Staphylococcus aureus in the blood of sheeps[J].Occupational Health and Emergency Rescue,2004,22（1）：51.

[35]王 林,梅 力,韋海濤,等.北京地區(qū)奶牛隱性乳房炎金黃色葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36（4）：124-127.WANG Lin,MEI Li,WEI Hai-tao,et al.Isolation,identification and drug sensitivity test of Staphylococcus aureus from dairy cow with subclinical mastitis in Beijing[J].Progress in Veterinarty Medicine,2015,36（4）：124-127.

[36]邱 梅,郝智慧,張萬(wàn)江,等.動(dòng)物源金黃色葡萄球菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27（7）：356-359.QIU Mei,HAO Zhi-hui,ZHANG Wan-jiang,et al.Isolation and identification of Staphylococcus aureus from animals and drug resistance analysis[J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2011,27（7）：356-359.

[37]熊云梅.牛、羊場(chǎng)環(huán)境中氣載需氧菌及金黃色葡萄球菌的檢測(cè)與散播研究[D].晉中：山西農(nóng)業(yè)大學(xué),2016：7-8.XIONG Yun-mei.The detection and spread of airbone aerobic bacteria and Staphylococcus aureus in cattle and sheep farms[D].Jinzhong：Shanxi Agriculture University,2016:7-8.

[38]柴同杰,趙云玲,劉 輝,等.雞舍耐藥細(xì)菌氣溶膠鑒定及某向環(huán)境傳播的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2003,23（3）：209-214.CHAI Tong-jie,ZHAO Yun-ling,LIU Hui,et al.The resistance against antibiotics of bacteria from a poultry house and their spreading to surroundings of the house[J].Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine,2003,23（3）：209-214.

[39]柳敦江.養(yǎng)雞場(chǎng)舍環(huán)境攜帶耐藥基因的金黃色葡萄球菌的氣溶膠形成及傳播研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2012：45-46.LIU Dun-jiang.Formation and transmission of the bacterial Staphylococcus aureus carrying antibiotic-resistant genes in a poultry farming environment[D].Taian:Shandong Agriculture University,2012：45-46.

[40]葉小華.動(dòng)物源性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌跨宿主感染的風(fēng)險(xiǎn)研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué),2015：53-54.YE Xiao-hua.Risk of cross-species infection of livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus[D].Guangzhou：Southern Medical University,2015：53-54.