黨參對壓力負(fù)荷致心衰小鼠電生理重構(gòu)的影響

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心力衰竭(HF)是各種結(jié)構(gòu)改變或功能減退的心臟疾病導(dǎo)致心室充盈及(或)射血能力受損而引起的一組復(fù)雜的臨床綜合征[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)達(dá)國家1%～2%的成年人患有HF，70歲以上的人群中HF發(fā)病率可高達(dá)10%[2]。大約有50%的HF病人在診斷后5年內(nèi)死亡[3]，其中有50%的死亡原因是心源性猝死[4]。電生理重構(gòu)導(dǎo)致的惡性心律失常是HF病人死亡的重要原因之一[5]。電生理重構(gòu)是指在HF時(shí)，由于心肌細(xì)胞病理生理機(jī)制發(fā)生變化，而改變其電沖動(dòng)的產(chǎn)生及傳導(dǎo)[6]。目前，臨床上仍缺少針對HF電生理重構(gòu)的有效藥物。中醫(yī)認(rèn)為，氣虛血瘀水停是HF的基本病機(jī)，而氣虛貫穿HF發(fā)展始終[7]，黨參是臨床防治HF常用的益氣藥。本實(shí)驗(yàn)通過使用黨參干預(yù)壓力負(fù)荷導(dǎo)致HF小鼠，觀察黨參對HF小鼠電生理重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級健康雄性C57BL/6J小鼠25 g±5 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK(京)2012- 0001，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物房，每天定時(shí)喂食、喂水并清潔動(dòng)物房。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及配制溶液 中藥黨參顆粒制劑，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院；酒石酸美托洛爾(倍他樂克)：阿斯利康制藥有限公司，生產(chǎn)批號：1209047；水合氯酸為國產(chǎn)分析純試劑；咖啡因；丁卡因；配制溶液：臺(tái)氏液，KB液，消化液，0Ca/0Na臺(tái)式液，30%丙烯酰胺溶液，4×分離膠緩沖液(1.5M Tris- HCl，pH 8.8，200 mL)，4×積層膠緩沖液(0.5M Tris- HCl，pH6.8，50 mL)，10%過硫酸銨，10×電泳緩沖液，染色液，脫色液，麗春紅染液，10×PBS，轉(zhuǎn)膜緩沖液，5%封閉液。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 單細(xì)胞動(dòng)緣探測系統(tǒng)(IonOptix，USA)，電子刺激器 SEN 27103 (IonOptix，USA)，小動(dòng)物超聲心動(dòng)檢測系統(tǒng)(Vevo770 ultrasound system，Visual Sonics Inc，USA)，心電檢測平臺(tái)ecgTUNNEL(EMKA Technologies，F(xiàn)rance)，Langendorff心臟灌流系統(tǒng)，微電極B15014F(微探科學(xué)儀器有限公司)等。

1.4 縮窄小鼠胸主動(dòng)脈動(dòng)物造模 對麻醉后的小鼠于胸骨正中線處剪開皮膚，切口(0.5～1) cm，鈍性剝離肌肉。暴露主動(dòng)脈弓胸主動(dòng)脈分支處，將28- gauge注射器針頭平行放置于胸主動(dòng)脈上，用4號聚丙烯縫線將針頭和主動(dòng)脈結(jié)扎。假手術(shù)不結(jié)扎胸主動(dòng)脈，其余步驟同模型組。

1.5 實(shí)驗(yàn)干預(yù) 將手術(shù)成功后存活的小鼠隨機(jī)分為模型組、黨參組、西藥組，每組12只，常規(guī)喂養(yǎng)3 d后灌胃給藥。各組灌胃總量均為20 ml/kg，共灌胃4周。假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水灌胃；黨參組給予黨參6 g/(kg·d)灌胃；西藥組給予酒石酸美托洛爾10 mg(kg·d)灌胃。

1.6 超聲心動(dòng)檢測小鼠收縮和舒張功能 測量左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸收縮率(LVFS)，評價(jià)心臟收縮功能；測量舒張?jiān)缙诙獍昕谘魉俣?E)和舒張?jiān)缙谑议g隔運(yùn)動(dòng)速度(Ea)，并計(jì)算E/Ea，評價(jià)心臟舒張功能。各參數(shù)連續(xù)測量3個(gè)心動(dòng)周期，計(jì)算平均值。

1.7 心電圖檢測 使用ecgTUNNEL心電檢測平臺(tái)，檢測清醒狀態(tài)下6導(dǎo)聯(lián)體表心電圖。每只小鼠在記錄前適應(yīng)5 min后開始記錄20 min，使用IOX軟件(EMKA Technologies，F(xiàn)rance)記錄。使用ECGAuto軟件(EMKA Technologies，F(xiàn)rance)進(jìn)行分析，按參考文獻(xiàn)[8]設(shè)定心電圖分析模板，分析QT間期以及校正QT間期(corrected Q- T interval，QTc)。

1.8 鈣瞬變 心室肌細(xì)胞急性分離，各組小鼠在干預(yù)4周檢測心功能后，取出一段帶有主動(dòng)脈的心臟，通過Langendorff裝置上消化，最后使細(xì)胞保存在正常的含鈣臺(tái)式液(1.2 mmol/L Ca2+)備用。 鈣漏和鈣庫的檢測，選取橫紋清晰、收縮穩(wěn)定、邊界清楚的長桿狀細(xì)胞，利用IonOptix單細(xì)胞動(dòng)緣檢測系統(tǒng)測定細(xì)胞功能。檢測心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣漏、鈣庫。

1.9 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù) 細(xì)胞穩(wěn)定10 min后，給予1.5倍閾上刺激的電流(時(shí)程3 ms～5 ms)以誘發(fā)動(dòng)作電位，刺激頻率為0.2 Hz或2.0 Hz，記錄動(dòng)作電位，分析動(dòng)作電位復(fù)極90%時(shí)間(APD90)。

1.10 Western Blot檢測 運(yùn)用Western Blot檢測干預(yù)后各組SERCA、PLB、CAMK蛋白水平及活性。對總蛋白進(jìn)行提取、濃度測定、制備相應(yīng)濃度的分離膠及濃縮膠，并進(jìn)行分離與濃縮，在濃縮膠聚合的過程中，將樣品與適量蛋白上樣緩沖液充分混勻，加熱使蛋白變性，待濃縮膠聚合完全，把凝膠固定于垂直電泳裝置上，槽內(nèi)加入甘氨酸電泳緩沖液，將變性后的蛋白樣品和預(yù)染蛋白Marker小心地加入上樣槽進(jìn)行電泳，調(diào)整電壓，電泳直至溴酚藍(lán)至分離膠底部時(shí)停止，凝膠用適量轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡后即可進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)后進(jìn)行ECL顯影，使用軟件進(jìn)行蛋白印跡分析，檢測相應(yīng)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠存活情況 術(shù)后4周模型組小鼠死亡3只，假手術(shù)組無小鼠死亡，黨參組小鼠死亡3只，西藥組小鼠死亡5只。

2.2 小鼠心臟功能 與假手術(shù)組相比，模型組LVEF、FS顯著降低，E/Ea顯著升高(P<0.01)，表明壓力負(fù)荷增加導(dǎo)致小鼠HF。與模型組相比，黨參組LVEF、FS顯著提高(P<0.01)，表明黨參可改善HF小鼠心臟收縮功能，而西藥對心功能舒縮功能改善均不明顯。詳見表1。左室短軸切面和M型超聲詳見圖1。

表1 黨參對HF小鼠左室功能的影響(±s)

圖1左室短軸切面和M型超聲

2.3 電生理重構(gòu)

2.3.1 QT間期、校正QT間期 與假手術(shù)組相比，模型組QT間期、QTc均顯著延長(P<0.01)，表明壓力負(fù)荷導(dǎo)致了小鼠電生理重構(gòu)。與模型組相比，黨參組小鼠QTc縮短(P<0.01)，說明黨參可改善電生理重構(gòu)，而西藥組心電參數(shù)改善不明顯。詳見表2。

表2 黨參對HF小鼠QT間期、QTc的影響(±s)

2.3.2 細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極90%時(shí)間(APD90) 模型組與假手術(shù)組相比，在0.2 Hz、2.0 Hz頻率刺激下心肌細(xì)胞APD90均顯著延長(P<0.01)；黨參組與模型組相比，在0.2 Hz、2.0 Hz頻率刺激下心肌細(xì)胞APD90顯著縮短(P<0.01)；西藥組與模型組相比，APD90無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示黨參可改善電生理重構(gòu)，而西藥組無明顯改善作用。詳見表3。

表3 黨參對HF小鼠0.2 Hz、2.0 Hz頻率刺激下心肌細(xì)胞APD90的影響(±s) ms

2.4 鈣漏和鈣庫 與假手術(shù)組相比，模型組鈣滲漏顯著增加(P<0.01)，基線水平和鈣庫容量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，黨參組鈣漏減小(P<0.05)，說明黨參可抑制肌漿網(wǎng)鈣漏，而西藥組對肌漿網(wǎng)鈣漏的無明顯抑制作用。詳見表4。鈣漏和鈣庫的測量詳見圖2。

表4 黨參對HF小鼠心肌細(xì)胞鈣漏和鈣庫的影響(±s)

圖2鈣漏和鈣庫的測量

2.5 鈣循環(huán)相關(guān)蛋白表達(dá)含量 與假手術(shù)相比，模型組SERCA、PLB及其比值無明顯變化，而CAMK表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，黨參組CAMK表達(dá)含量降低(P<0.05)。詳見表5、圖3～圖5。

表5 鈣循環(huán)相關(guān)蛋白表達(dá)含量(±s)

圖3 SERCA表達(dá)含量

圖4 PLB表達(dá)含量

圖5 CAMKⅡ表達(dá)含量

3 討 論

近幾十年中醫(yī)在HF辨證防治方面做了大量的研究工作，現(xiàn)較為統(tǒng)一完整的認(rèn)識(shí)是，HF病機(jī)概括為本虛標(biāo)實(shí)，即在氣虛、陽虛之人體正虛的基礎(chǔ)上存在血瘀、水飲、痰飲等實(shí)邪。郭維琴指出氣虛血瘀是HF最根本的病機(jī)，亦體現(xiàn)本虛標(biāo)實(shí)是HF之根本，氣虛血瘀和陽虛水泛為基本病機(jī)[9]。鄧鐵濤認(rèn)為[10]，就HF病機(jī)而言，依然可以認(rèn)為是經(jīng)典的本虛標(biāo)實(shí)，本為心之陽氣虧虛或兼以心陰虧虛，標(biāo)為瘀血兼以水停。陳可冀用“虛”“瘀”“水”三個(gè)字高度概括HF發(fā)生發(fā)展的病機(jī)[11]。林謙等[12]研究提示HF在發(fā)生發(fā)展變化過程中最常見的證候是氣虛血瘀水停，并在中醫(yī)氣血理論基礎(chǔ)的指導(dǎo)下，結(jié)合自身臨床經(jīng)驗(yàn)，首創(chuàng)了具有針對性的“益氣活血利水”方，對于改善病人臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、改善心功能等多方面療效顯著。

黨參作為補(bǔ)益藥物最早見于清朝吳儀洛《本草從新》[13]?，F(xiàn)代研究表明黨參中富含皂苷和微量生物堿等多種化學(xué)成分，具有補(bǔ)中益氣等功效[14]。王碩仁等[15]研究發(fā)現(xiàn)服用黨參提取液可明顯提高左室舒張期E波峰值和左房室間壓力階差，顯著縮短左室舒張?jiān)缙诔溆瘯r(shí)間，明顯增加左室收縮功能的心輸出量；同時(shí)，黨參可明顯提高小白鼠心肌糖原、琥珀酸脫氫酶的含量，成為黨參改善心肌能量代謝、補(bǔ)氣強(qiáng)心作用的機(jī)制之一。

電生理重構(gòu)導(dǎo)致的惡性心律失常是HF病人死亡的重要原因之一，嚴(yán)重影響HF病人的預(yù)后[16]。電生理重構(gòu)在HF時(shí)，病理生理機(jī)制變化，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的電活動(dòng)發(fā)生異常，其最重要的表現(xiàn)為獲得性QT間期、APD延長，這與心肌細(xì)胞除極、復(fù)極速度不同步有關(guān)[17]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在縮窄胸主動(dòng)脈4周后，小鼠LVEF、LVFS均下降，說明壓力負(fù)荷致HF造模成功；QT間期、APD延長，出現(xiàn)了電生理重構(gòu)。黨參組可縮短QTc和APD90，療效優(yōu)于西藥(倍他樂克)組，說明黨參對電生理重構(gòu)有一定改善作用。

在興奮- 收縮耦聯(lián)過程中，鈣庫內(nèi)鈣離子經(jīng)肌漿網(wǎng)上雷尼丁受體(RyR2)釋放入細(xì)胞質(zhì)中，與橫橋結(jié)合，細(xì)胞收縮；舒張期時(shí)由肌漿網(wǎng)上鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SERCA2a)及其調(diào)節(jié)蛋白受磷蛋白(phospholamban，PLB)將鈣離子運(yùn)回鈣庫內(nèi)[18]。在HF心肌細(xì)胞中，RyR2穩(wěn)定性降低，舒張期鈣通道異常開放，在舒張期發(fā)生鈣離子的釋放，形成產(chǎn)生鈣滲漏[19- 20]。舒張期鈣離子的異常釋放，能激活Na/Ca通道，影響心肌細(xì)胞的復(fù)極，引發(fā)后除極。在某些嚴(yán)重的情況下，可誘發(fā)嚴(yán)重的惡性室性心律失常，最終導(dǎo)致心源性猝死[21- 22]。而本實(shí)驗(yàn)中，黨參可明顯抑制鈣漏，可能與抑制CAMKⅡ表達(dá)有關(guān)，而倍他樂克無此效果。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子含量及鈣庫含量無明顯變化，可能與SERCA2a、PLB功能不受影響有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，黨參可改善壓力負(fù)荷導(dǎo)致HF小鼠電生理重構(gòu)，可能與通過抑制CAMKⅡ表達(dá)，抑制肌漿網(wǎng)鈣漏有關(guān)。

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