紅花籽粕氨基酸態(tài)氮酶法水解工藝優(yōu)化

魏娜，呂凱波（武漢工商學(xué)院實驗教學(xué)中心，湖北武漢430065）

紅花籽，是紅花（Carthamus tinctorius L.）的種子，又被稱作“白平子”[1]。紅花籽粕（safflower meal）是指從紅花籽中提取紅花籽油后得到的副產(chǎn)品[2]。紅花作為一種新型的油料作物，目前廣泛分布在世界20多個國家，其中在印度、加拿大等國產(chǎn)量最多[3-5]。紅花籽粕本身含有較高的粗蛋白和多種氨基酸，但是目前大多數(shù)只作為廉價的肥料和飼料，使蛋白質(zhì)等資源無法得到有效利用[6-7]。

氨基酸態(tài)氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量。該含量越高，說明產(chǎn)品中蛋白質(zhì)水解率越高，氨基酸含量越高，營養(yǎng)越好[8-10]。隨著食品科學(xué)的發(fā)展和營養(yǎng)知識的普及，食物蛋白質(zhì)中氨基酸含量的高低越來越得到人們的重視，為拓寬紅花籽粕綜合利用前景，本試驗對酶法輔助紅花籽粕的水解工藝進行優(yōu)化，從而提高紅花籽粕中氨基酸態(tài)氮的含量，為日后紅花籽粕綜合利用及開發(fā)功能性食品提供科學(xué)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 材料

紅花籽粕，產(chǎn)地中國。

1.1.2 儀器與試劑

電子天平：日本島津；HS-4（B）型恒溫浴槽：廣東佛山；722可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器、79-2磁力加熱攪拌器：常州國華電器有限公司；5810R離心機：德國艾本德（Eppendorf）股份公司；PB-21 pH計：德國Sartorius賽多利斯。

商業(yè)酶：胰蛋白酶（parenzyme，2 500 U/mg）、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶（bacillus subtilis neutral protease，150 U/mg）、木瓜蛋白酶（papain，2 400 U/mg）購自諾維信公司；所用試劑甲醛、鄰苯二甲酸氫鉀、無水硫酸鉀、NaOH、酚酞指示劑、鹽酸、中性紅指示劑等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 測定指標及方法

1.2.1.1 標準氫氧化鈉溶液的標定[11]

用酸性的鄰苯二甲酸氫鉀（KHC8H4O4，相對分子質(zhì)量204.22）作為基準物質(zhì)，可先準確稱量分析純的鄰苯二甲酸氫鉀3份，每份0.42 g，分別置于150 mL三角瓶，各加入20 mL無離子水，使全部溶解，加酚酞指示劑3~4滴，用待測的NaOH溶液滴定至淡紅色為止，記錄用去的NaOH的體積，求平均值，按下式計算得NaOH的標準濃度：

式中：m 為 KHC8H4O4的質(zhì)量，g；Mr為 KHC8H4O4的相對分子質(zhì)量；V為NaOH的滴定體積，mL。

1.2.1.2 甲醛滴定法[12-13]

移取2 mL抽濾的樣品溶液2份，分別置于250 mL的錐形瓶中，加水25 mL；其中一份加3滴中性紅指示劑，用上述標定的NaOH滴定至琥珀色為終點。另一份加入中性甲醛10 mL及3滴百里酚酞指示劑，搖勻，靜置1 min，（此時藍色消失）。再用上述標定過的NaOH溶液滴定至淡藍色。記錄兩次滴定所消耗的NaOH的毫升數(shù)，用下述公式計算。

式中：N為NaOH標準溶液當量濃度，g/mL；V1為測定樣品消耗NaOH標準溶液的體積，mL；V2為測定空白消耗NaOH標準溶液的體積，mL；W為樣品溶液相當樣品的質(zhì)量，g。

1.2.2 酶解反應(yīng)[14-18]

對胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢桿菌中性蛋白酶分別進行水解試驗，并對以下幾個因素進行考察。

1.2.2.1 料液比

在酶解溫度為45℃，酶用量為1%，作用時間為3 h時，每組均取5.00 g紅花籽粕，料液比分別為1∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9、1 ∶11（g/mL），抽濾，用甲醛滴定法滴定，并記錄消耗的NaOH體積。

1.2.2.2 酶用量

在酶解溫度為45℃，作用時間為3 h時，料液比為1∶3（g/mL），每組均取5.00 g紅花籽粕，酶用量分別為1%、2%、3%、4%、5%，抽濾，用甲醛滴定法滴定，并記錄消耗的NaOH體積。

1.2.2.3 酶解溫度

酶用量為1%，作用時間為3 h，料液比為1∶3（g/mL），每組均取5.00 g紅花籽粕，選取酶解溫度為30、35、40、45、50 ℃，抽濾，用甲醛滴定法滴定，并記錄消耗的NaOH體積。

1.2.2.4 作用時間

在酶解溫度為45℃，酶用量為1%，料液比為1∶3（g/mL），每組均取5.00 g紅花籽粕，作用時間分別為 1、2、3、4、5 h 抽濾，用甲醛滴定法滴定，并記錄消耗的NaOH體積。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0軟件和Design Expert 8.5數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌中性蛋白酶水解紅花籽粕中氨基酸態(tài)氮的影響

對3種不同酶分別水解紅花籽粕工藝條件的主要因素進行單因素試驗，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢桿菌中性蛋白酶分別水解紅花籽粕中氨基酸態(tài)氮含量最高時料液比分別為 1 ∶3、1 ∶3、1 ∶3（g/mL）；酶用量分別為2%、2%、4%；酶解溫度分別為55、55、45℃；作用時間分別為 4、3、3 h。

2.2 最佳工藝條件的確定

2.2.1 胰蛋白酶水解紅花籽粕的正交試驗結(jié)果

圖1 不同因素對3種酶分別水解紅花籽粕中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effect of the single-factor experiments on the amino acid nitrogen of safflower meal

根據(jù)單因素結(jié)果，以 A（料液比）、B（酶用量）、C（酶解溫度）、D（酶作用時間）進行正交試驗，以氨基酸態(tài)氮含量為指標的正交試驗結(jié)果如表1所示。

表1 胰蛋白酶水解紅花籽粕正交試驗結(jié)果Table 1 Orthogonal results of safflower meal hydrolyzed by parenzyme

根據(jù)極差R大小，得出各因素影響蛋白質(zhì)提取效果的主次順序為：A（料液比）＞B（酶用量）＞D（酶作用時間）＞C（酶解溫度），結(jié)果表明：胰蛋白酶水解紅花籽粕的最佳工藝參數(shù)為A1B2C2D2，即料液比1∶3（g/mL）、酶用量為2%、酶解溫度為45℃、酶作用時間3.0 h，在此最佳工藝進行驗證試驗，所得到的氨基酸態(tài)氮含量最高，達到7.7%。

2.2.2 木瓜蛋白酶水解紅花籽粕的正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素結(jié)果，以A（料液比）、B（酶用量）、C（酶解溫度）、D（酶作用時間）進行正交試驗，以氨基酸態(tài)氮含量為指標的正交試驗結(jié)果如表2所示。

表2 木瓜蛋白酶水解紅花籽粕正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal results of safflower meal hydrolyzed by papain

續(xù)表2 木瓜蛋白酶水解紅花籽粕正交試驗結(jié)果Continue table 2 Orthogonal results of safflower meal hydrolyzed by papain

根據(jù)極差R大小，得出各因素影響蛋白質(zhì)提取效果的主次順序為：A（料液比）＞D（酶作用時間）＞B（酶用量）＞C（酶解溫度），結(jié)果表明：木瓜蛋白酶水解紅花籽粕的最佳工藝參數(shù)為 A1B2C2D3，即料液比 1∶3（g/mL）、酶用量為2.0%、酶解溫度為55℃、酶作用時間4.0 h，在此最佳工藝進行驗證試驗，所得到的氨基酸態(tài)氮含量最高，達到8.2%。

2.2.3 枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解紅花籽粕的正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素結(jié)果，以 A（料液比）、B（酶用量）、C（酶解溫度）、D（酶作用時間）進行正交試驗，以氨基酸態(tài)氮含量為指標的正交試驗結(jié)果如表3所示。

表3 枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解紅花籽粕正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal results of safflower meal hydrolyzed by bacillus subtilis neutral protease

根據(jù)極差R大小，得出各因素影響蛋白質(zhì)提取效果的主次順序為：C（酶解溫度）＞B（酶用量）＞D（酶作用時間）＞A（料液比），結(jié)果表明：枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解紅花籽粕的最佳工藝參數(shù)為A1B2C1D3，即料液比 1∶3（g/mL）、酶用量為 2.0%、酶解溫度為 40℃、酶作用時間4.0 h，在此最佳工藝進行驗證試驗，所得到的氨基酸態(tài)氮含量最高，達到4.27%。

3 結(jié)論

1）選用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶3種商業(yè)酶分別水解紅花籽粕，胰蛋白酶水解紅花籽粕得到的氨基酸態(tài)氮含量為7.7%，木瓜蛋白酶水解紅花籽粕得到的氨基酸態(tài)氮含量為8.2%，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解紅花籽粕得到的氨基酸態(tài)氮含量為4.27%，可知木瓜蛋白酶水解能力較強。

2）酶法水解最佳工藝條件分別為：①胰蛋白酶：料液比 1∶3（g/mL）、酶用量為 2%、酶解溫度為 45℃、酶作用時間3.0 h，氨基酸態(tài)氮含量7.7%；②木瓜蛋白酶：料液比 1∶3（g/mL）、酶用量為 2.0%、酶解溫度為55℃、酶作用時間4.0 h，氨基酸態(tài)氮含量8.2%。③枯草芽孢桿菌中性蛋白酶：料液比1∶3（g/mL）、酶用量為2.0%、酶解溫度為40℃、酶作用時間4.0 h，氨基酸態(tài)氮含量最高為4.27%。

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