陳超 林冬銘 吳源鴻 黃抒偉
Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解蛋白樣金屬蛋白酶-1(ADAMTS-1)是一種新發(fā)現(xiàn)的金屬蛋白酶,其金屬蛋白酶結構區(qū)域含有鋅離子(Zn2+)結合部位,是Zn2+依賴性金屬蛋白酶家族的新成員[1]。ADAMTS-1基因rs402007位點位于第1外顯子區(qū),轉錄后為5′-UTR區(qū),提示可能參與翻譯調節(jié),影響mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率等。前期研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-1基因rs402007位點多態(tài)性與腦梗死、冠心病等眾多心腦血管疾病有關,但其具體機制還不清楚[1-2];近來研究表明低度炎性反應伴隨心腦血管疾病始終,兩者之間相互影響,是一個惡性循環(huán)的關系[3]。C反應蛋白(CRP)在炎癥反應中起重要作用,本研究旨在闡明ADAMTS-1基因多態(tài)性與血清CRP之間的關系,探討ADAMTS-1基因多態(tài)性致頸動脈斑塊形成的機制。
1.1 對象 2015年6月至2016年9月在我院體檢中心檢查的受試者684例,由2位高年資超聲科醫(yī)生進行頸動脈超聲檢查及診斷,根據(jù)檢查結果有無斑塊將其分為斑塊組和對照組。斑塊組383例,其中男 229例,女 154例,年齡 47~76(69.54±9.67)歲。對照組301例,其中男168例,女133例,年齡44~75(61.73±11.14)歲。所有的研究對象之間無親緣關系。排除標準:有感染性疾病、急性腦梗死、急性心肌梗死、風濕性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、外傷性疾病、嚴重的肝腎疾病的患者。研究方案通過我院倫理委員會批準,全部研究對象均簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 生化指標測定 抽取清晨空腹肘靜脈血2ml至EP管,用美國Beckman公司生產的離心機(ALLEGRA X-12centrifuge)分離血清,分離好的血清標本儲存于-80℃冰箱,避免反復凍融。ELISA法測定血清CRP水平。
1.2.2 基因組DNA抽提 用血液基因組DNA抽提試劑盒(上海捷瑞生物工程公司)提取基因組DNA,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3 引物設計和PCR反應 從Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得含有rs402007位點的ADAMTS1基因目的片段序列,輸入Primer5.0軟件合成引物(上游引物:5′-GGCGTCTTTGGGATGGAA-3′;下游引物:5′-CAGGAGACACCGCTCGTAG-3′)。反應體系 25μL包括1.0μl DNA模板,上下游引物各0.5μl,MixdNTP(10mmol/L)0.5μl,10×緩沖液 2.5μl,Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.25μl,Mg2+(25mmol/L)1.0μl,雙蒸餾水18.75μl。反應條件:95℃2min,94℃45s,56℃45s,72℃1min,35個循環(huán),72℃延伸 10min;1.8%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,凝膠成像分析儀下分析。
1.2.4 測序和突變分析 對樣本的PCR擴增產物用ABI-PRISM3730全自動測序儀進行檢測,對瓊脂凝膠中的目的DNA片段純化后直接寄往上海生工生物有限公司測序部測序。
1.2.5 觀察指標 比較斑塊組與對照組兩組間年齡、糖尿病、高血壓、吸煙史、飲酒史、LDL-C、TG、TC、CRP、等位基因頻率及基因型的差異;比較不同基因型及基因頻率間CRP血清水平的差異。
1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料之間比較采用χ2檢驗;計量資料以或四分位數(shù)表示,比較采用t檢驗或非參數(shù)秩和檢驗;采用二元logistic回歸分析危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 兩組受試者一般資料比較 兩組受試者糖尿病、高血壓、吸煙、年齡、LDL-C比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),飲酒、TG、TC 比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表 1。
表1 兩組受試者一般資料比較[例(%)]
2.2 ADAMTS-1基因rs402007檢測序列圖 見圖1。
2.3 兩組受試者ADAMTS1基因型頻率和等位基因頻率比較 見表2。
由表2可見,斑塊組GG基因型頻率低于對照組,GC、CC基因型頻率高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。兩組G、C等位基因頻率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組間rs402007位點均符合 Hardy-Weinberg 平衡(χ2=0.643、0.205,P=0.423、0.651)。
圖1 ADAMTS-1基因rs402007檢測序列圖:CC/GC/GG;GG:野生純合子;GC:突變雜合子;CC:突變純合子
表2 兩組受試者ADAMTS-1基因型頻率和等位基因頻率比較[例(%)]
2.4 ADAMTS-1基因型及等位基因致病風險分析見表3。
表3 ADAMTS-1基因型及等位基因致病風險分析
由表3可見,C等位基因攜帶者可使斑塊發(fā)生的患病風險增加1.37倍;GC、CC與GG相比,分別使斑塊患病風險增加1.416倍及1.812倍。
2.5 兩組及各基因型間CRP的比較 斑塊組血清 CRP 水平為 0.81(0.35,1.24)mg/L,高于對照組0.58(0.22,1.13)mg/L,差異有統(tǒng)計學意義(Z=-3.667,P=0.000)。GC組、CC組、GG組CRP水平分別為0.82(0.34,1.26)、0.94(0.42,1.45)、0.39(0.21,0.68)mg/L,其中GG組與GC組、CC組比較,差異有統(tǒng)計學意義(Z=-6.794、-6.213,均P<0.01)。此外,GG組與GC+CC組 0.91(0.31,1.47)mg/L 比較,差異有統(tǒng)計學意義(Z=-8.384,P<0.01)。
2.6 頸動脈斑塊的多因素logistic回歸分析 見表4。
由表4可見,ADAMTS-1 rs402007位點GC+CC基因型較GG基因型增加斑塊患病風險(OR=1.552;95%CI:1.093~2.203),此外高血壓病史、年齡、LDL-C水平升高、吸煙也是斑塊產生的獨立危險因素。
表4 頸動脈斑塊的多因素logistic回歸分析
動脈粥樣硬化是動脈壁炎性-纖維增生性病變,是導致急性心腦血管疾病發(fā)生的主要原因。遺傳易感性及環(huán)境危險因素是目前動脈粥樣硬化的防治重點[4-5]。研究已證實,ADAMTS-1基因rs402007位點C等位基因是急性大動脈粥樣硬化性腦梗死的遺傳易感基因,但其致病機制尚未完全清楚[1]。近年資料證明:CRP水平通過刺激膠原纖維和平滑肌增生,促使動脈血管壁結構改變,激活補體系統(tǒng),大量炎癥介質及自由基同時產生和釋放,與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展有密切的關系[6-7]。進一步推測ADAMTS-1基因rs402007位點G>C突變可能通過調節(jié)血清CRP水平影響斑塊發(fā)生、發(fā)展及穩(wěn)定性,從而增加心腦血管疾病的患病風險。
本研究中我們應用病例-對照設計,進行ADAMTS-1基因多態(tài)性、血清CRP水平及頸動脈斑塊3者之間的關聯(lián)性研究。研究結果表明,斑塊組血清CRP水平較對照組升高,差異有統(tǒng)計學意義,提示CRP水平與動脈粥樣硬化病變過程相關。斑塊組rs402007位點GC+CC基因型頻率及C等位基因頻率均較對照組高,logistic回歸分析提示其為斑塊形成的獨立危險因素,C等位基因攜帶者患動脈斑塊的風險較無C等位基因攜帶者高1.552倍,提示C等位基因是動脈粥樣硬化及斑塊形成的一個遺傳易感等位基因。而C等位基因攜帶者血清CRP水平較無C等位基因攜帶者顯著高,提示ADAMTS-1基因rs402007位點G>C突變與炎癥因子的表達有密切聯(lián)系,證實了我們的推測。本研究結果顯示rs402007位點G和C等位基因頻率分別為0.572和0.428,符合浙江漢族人群的基因分布。
CRP是一種短鏈正五聚蛋白(PTX),主要在肝臟合成,在機體急性及慢性炎癥中具有重要作用。而ADAMTS-1作為一種炎癥相關蛋白,已被證實與炎癥反應密切相關[8-9]。本次研究進一步發(fā)現(xiàn)ADAMTS-1基因rs402007位點G>C突變與炎癥因子CRP的表達有密切聯(lián)系,分析原因,ADAMTS-1基因rs402007位點G>C突變通過影響ADAMTS-1蛋白表達,一方面,直接刺激血管平滑肌細胞(VSMCs)釋放CRP[10];另一方面,激活單核巨噬細胞NADPH氧化酶,促進ROS產生,ROS可以活化促炎轉錄因子激活蛋白-1和NF-kB,誘導CRP的產生[11]。本次研究未涉及相關機制,因此在接下來的研究中,我們將從分子表達通路角度進行進一步研究。
綜上所述,ADAMTS-1基因rs402007位點C等位基因是動脈粥樣硬化及斑塊形成的一個遺傳易感等位基因;G>C突變通過影響炎癥因子的表達影響斑塊發(fā)生、發(fā)展及穩(wěn)定性增加心腦血管疾病的患病風險。
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(本文系第十一屆錢江國際心血管病會議優(yōu)秀論文)