長效重組人凝血因子Ⅷ研究現(xiàn)狀及進(jìn)展

魯?shù)?，曾凡?3

1 上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所，上海 200040

2 衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)胚胎分子生物學(xué)重點(diǎn)實驗室暨上海市胚胎與生殖工程重點(diǎn)實驗室，上海 200040

3 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)科學(xué)院發(fā)育生物學(xué)研究室，上海 200025

凝血因子Ⅷ (Factor Ⅷ，F(xiàn)Ⅷ) 是由肝臟中的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的糖蛋白，它在止血過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。由于 FⅧ缺乏引起的血友病稱之為血友病A(Haemophilia A，HA)，是臨床上最普遍的血友病類型，約占血友病患者總數(shù)的 80%以上，其中男性發(fā)病率約為1/5 000[2]。HA患者病情嚴(yán)重程度與FⅧ缺乏程度密切相關(guān)，其中重度 HA患者體內(nèi) FⅧ的含量小于正常人含量的1%，臨床上表現(xiàn)為關(guān)節(jié)、肌肉、內(nèi)臟及深部組織等自發(fā)性出血或外部損傷后出血不易凝固，出血量偏高，嚴(yán)重時甚至?xí)＜盎颊呱黐3]。

目前，對于 HA患者的主要治療方法為 FⅧ替代療法，即定期給 HA患者輸入 FⅧ，維持患者體內(nèi)FⅧ的含量最小為1%。但是FⅧ的半衰期較短，約為12 h左右，在兒童體內(nèi)更短，患者需要隔天或者每周 3次進(jìn)行靜脈注射治療[4]。傳統(tǒng)的 FⅧ制備方法是從人血液中進(jìn)行提取和純化 FⅧ純品，但該方法血液來源有限，成本很高，此外血液容易受到病毒污染，導(dǎo)致 FⅧ制品的安全性問題。為了解決上述問題，人們利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)長效重組FⅧ (rFⅧ)，通過結(jié)構(gòu)改造不斷改善重組蛋白的活性、穩(wěn)定性和延長其半衰期。下面就FⅧ的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理、目前延長FⅧ半衰期的方法、FⅧ與血管性血友病因子 (von Willebrand Factor，vWF) 相互作用對延長 FⅧ半衰期的影響以及未來長效rFⅧ研發(fā)的策略等幾個方面對長效重組人凝血因子Ⅷ研究現(xiàn)狀及進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 FⅧ結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理

FⅧ基因位于X染色體長臂上 (Xq28)，全長約為186 kb，包含26個外顯子和25個內(nèi)含子。FⅧ的mRNA長約9 kb，其編碼的蛋白前體含有2 351個氨基酸殘基 (其中信號肽由 19個氨基酸殘基組成)，而成熟的FⅧ蛋白由2 332個氨基酸殘基組成[5]。成熟的 FⅧ蛋白空間上含有 A、B和 C三種結(jié)構(gòu)域，在一級結(jié)構(gòu)上的排列順序為A1-A2-B-A3-C1-C2[6]。三個A結(jié)構(gòu)域均由約330個氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)域間以及與血銅藍(lán)蛋白間的同源性約為40%。C結(jié)構(gòu)域偏小，由約160個氨基酸殘基組成，與多種盤狀蛋白質(zhì)折疊家族成員具有相對較遠(yuǎn)的同源關(guān)系。B結(jié)構(gòu)域含有較多的糖基化修飾，具有較低的同源性[7]。在B結(jié)構(gòu)域上存在著蛋白酶 furin的識別位點(diǎn) R1313和R1648[6]。在FⅧ分泌前，蛋白酶furin會在R1648對單鏈FⅧ進(jìn)行剪切，產(chǎn)生一條由A3-C1-C2組成的輕鏈 (80 kDa) 和一條由A1-A2-B組成的重鏈(90–210 kDa)[8]。由于蛋白在加工過程中furin也可能對R1313或其前后進(jìn)行酶切，導(dǎo)致分泌后FⅧ的重鏈長短不一。FⅧ的輕鏈和重鏈以二價金屬離子結(jié)合形成異質(zhì)二聚體糖蛋白。圖1顯示了凝血因子Ⅷ蛋白結(jié)構(gòu)的示意圖。

分泌后的FⅧ會與vWF結(jié)合形成FⅧ/vWF復(fù)合物，共同進(jìn)行血液循環(huán)。一旦血管發(fā)生損傷，F(xiàn)Ⅷ將進(jìn)一步發(fā)生酶解產(chǎn)生活化的 FⅧ復(fù)合物 (Activate FⅧ，F(xiàn)Ⅷa)，并與vWF解離結(jié)合到活化的血小板上[9]。凝血級聯(lián)反應(yīng)主要包括兩種途徑——內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑。FⅧ作為啟動因子和調(diào)節(jié)因子參與到內(nèi)源性凝血途徑中。血管發(fā)生出血性損傷后，在活化的FⅩ (Activated FⅩ，F(xiàn)Ⅹa) 或者凝血酶的激活下被蛋白酶剪切，去掉B結(jié)構(gòu)域并斷開A1和A2結(jié)構(gòu)域，同時去除位于A3結(jié)構(gòu)域N端的a3酸性肽，使得FⅧ與vWF分離，從而形成由 A1/A2/A3-C1-C2組成的 FⅧa[9-10]。FⅧa隨后與活化的FⅨ (Activated FⅨ，F(xiàn)Ⅸa) 組成復(fù)合物，通過C2結(jié)構(gòu)域C端結(jié)合位點(diǎn)與活化的血小板結(jié)合，并激活 FⅩ?；罨蟮?FⅩ進(jìn)一步激活凝血酶從而完成凝血的作用[7]。

2 延長FⅧ半衰期的方法

凝血因子Ⅷ在人體內(nèi)的半衰期僅為 12 h左右，因此HA患者在預(yù)防和治療過程中需要長期反復(fù)注射rFⅧ制劑。長期頻繁靜脈注射治療不僅給患者帶來肉體上的痛苦，還容易產(chǎn)生FⅧ抗體，嚴(yán)重影響治療效果。因此，有效地延長rFⅧ制品的半衰期對于臨床治療和緩解患者痛苦具有十分重要的意義。目前已報道的成功延長rFⅧ半衰期的HA替代治療藥物開發(fā)采用的方法主要有：rFⅧ-Fc融合蛋白、聚乙二醇 (PEG) 聚合物修飾和單鏈結(jié)構(gòu) rFⅧ[2,11-12]。

2.1 rFⅧ-Fc融合蛋白

圖1 凝血因子Ⅷ蛋白結(jié)構(gòu)示意圖[7]Fig. 1 Domain structure of FⅧ[7]. The position of domain boundaries and main proteolytic processing sites when FⅧsecretion and activation are denoted by residue numbers and blue arrows. The black arrows indicate the position that different proteases interact with the activated heterotrimer.

圖2 rFⅧ-Fc融合蛋白和單鏈rhFⅧ的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Structure of rFⅧ-Fc and Single chain rhFⅧ. (A) The recombinant fusion protein linking factor Ⅷ with Fc(rFⅧ-Fc). (B) The single chain factor Ⅷ.

IgG與新生兒Fc受體 (FcRn) 結(jié)合的區(qū)域主要是Fc結(jié)構(gòu)域，與該結(jié)構(gòu)域融合的蛋白藥物能夠進(jìn)行 FcRn介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞和再循環(huán)過程，從而免受細(xì)胞內(nèi)降解，延長半衰期[13-14]。2002年，百健研發(fā)團(tuán)隊Dumont等將人IgG1的Fc結(jié)構(gòu)域與B結(jié)構(gòu)域缺失的FⅧ的C末端直接連接融合表達(dá)制備rFⅧ-Fc (圖2A)，經(jīng)蛋白酶解后，rFⅧ-Fc能夠產(chǎn)生 90 kDa的重鏈和 130 kDa的 Fc融合輕鏈，輕鏈和重鏈通過金屬非共價鍵連接。經(jīng)過活化部分凝血活酶時間 (APTT) 和顯色分析，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域與FⅧ融合并沒有影響到rFⅧFc的活性。隨后，該課題組進(jìn)行了動物體內(nèi)實驗，發(fā)現(xiàn)rFⅧFc在HA小鼠和HA狗體內(nèi)的半衰期分別延長了1倍和0.5–1.0倍[15]。rFⅧFc在HA患者體內(nèi)的安全性研究表明 rFⅧFc的攝入不會使患者產(chǎn)生抗體或抑制劑，且 rFⅧFc體內(nèi)的半衰期與 rFⅧ相比延長了0.5–1.0倍，使得患者的給藥頻率減少到每周1–2次[16-17]。此外，最新長期臨床Ⅲ期研究 (A-LONG研究) 結(jié)果表明，rFⅧFc對成年HA患者和兒童，以及重度HA患者進(jìn)行長期的預(yù)防和治療過程中，均表現(xiàn)出良好的安全性、有效性和耐受性，進(jìn)一步保證了 rFⅧFc長期用藥的安全性[18-19]。2014年6月，百健公司宣布rFⅧFc通過了FDA上市審批，將其命名為ELOCTATE?，成為首個長效重組A型血友病藥物。

2.2 PEG修飾

聚乙二醇 (PEG) 是一種不帶電荷的親水線性大分子，通過選擇性地將它與蛋白的非必需基團(tuán)共價結(jié)合，可以保護(hù)蛋白質(zhì)不易被蛋白酶水解，減少免疫原性，延長蛋白藥物的半衰期。目前PEG修飾的 rFⅧ制品主要包括 N8-GP、BAX 855(Adynovate，Baxalta US Inc.，Westlake Village，CA)和 BAY 94-9027 (表 1)。2015年 11月，Baxalta公司的長效rFⅧ藥物Adynovate獲得了FAD的上市批準(zhǔn)，這是首個 PEG化長效 rFⅧ類產(chǎn)品。Adynovate是由Turecek等在百特公司的商品化重組全長 FⅧ (ADVATE?) 基礎(chǔ)上進(jìn)行特殊的定點(diǎn)PEG化修飾，藥代動力學(xué)研究表明在HA小鼠、大鼠和獼猴體內(nèi)，Adynovate的半衰期為FⅧ的2倍左右[20]。臨床實驗結(jié)果表明，在HA患者體內(nèi)，Adynovate的半衰期與ADVATE?(半衰期約12 h)相比延長了1.4–1.5倍，而且在HA成人和兒童預(yù)防與治療或者重度HA患者手術(shù)過程中，均表現(xiàn)出良好的止血效果和安全性[21-22]。

拜耳公司研發(fā)團(tuán)隊生產(chǎn)了位點(diǎn)特異PEG修飾的B區(qū)缺失FⅧ突變體 (BAY 94-9027)，體外實驗表明該突變體具有完整的凝血功能并能夠正常與vWF結(jié)合[23]。動物實驗表明，PEG化FⅧ突變體在HA小鼠和兔子體內(nèi)均明顯延長了rFⅧ的半衰期。臨床試驗中，rFⅧ在 HA患者體內(nèi)的半衰期延長到19 h[24-25]。

諾和諾德公司Agersoe等制備PEG修飾rFⅧ是將PEG連接在N8唯一的O-糖鏈處，該P(yáng)EG化FⅧ具有與天然FⅧ相似活性，在HA狗模型中的評估結(jié)果顯示，其半衰期較標(biāo)準(zhǔn)rFⅧ的半衰期增加了約1倍時間[26]，在HA患者體內(nèi)N8-GP的平均半衰期為19 h，延長到原來的1.6倍[27]。目前，N8-GP正處在臨床Ⅲ期試驗階段，已完成對重度 HA患者安全性和有效性評估，結(jié)果顯示N8-GP具有良好預(yù)防和治療效果，同時不存在安全性問題[28]。

表1 現(xiàn)階段臨床試驗長效重組FⅧ藥物比較Table 1 Half-life extended factor Ⅷ products in clinical trials

此外，百特公司還開發(fā)了與PEG化延長蛋白藥物半衰期方法相似的聚唾液酸 (PSA) 化 rFⅧ，其半衰期是內(nèi)源 FⅧ的 1.4倍左右，目前該 rFⅧ正處于臨床前研究階段[29]。

2.3 單鏈結(jié)構(gòu)rFⅧ

杰特貝林致力于單鏈結(jié)構(gòu) rhFⅧ的研發(fā)，他們將 FⅧ的重鏈和輕鏈以共價鍵進(jìn)行連接從而形成單鏈結(jié)構(gòu) rhFⅧ (Afstyla，CSL627) (圖 2B)，單鏈結(jié)構(gòu)的rhFⅧ加強(qiáng)了重鏈和輕鏈間的相互作用，同時表現(xiàn)出與vWF更強(qiáng)的親和力。臨床前研究表明，與全長rhFⅧ相比，CSL627表現(xiàn)出了更好的藥代動力學(xué)性質(zhì)，清除率降低了2倍而半衰期延長了1倍。CSL627與全長結(jié)構(gòu)rhFⅧ在動物體內(nèi)具有相當(dāng)?shù)纳锘钚裕o脈注射也沒有觀察到動物的不良反應(yīng)[11,30]。臨床Ⅰ期實驗比較了單劑量(50 IU/kg) CSL627和rFⅧ的藥代動力學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，與 rFⅧ相比，CSL627在所有患者體內(nèi)均表現(xiàn)出較低的清除速度，93%的病人體內(nèi)表現(xiàn)出更長的半衰期[31]。CSL627在臨床Ⅲ期實驗中也表現(xiàn)出了良好的治療和預(yù)防作用[32]。2016年5月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了 Afstyla用于A型血友病患者的治療，成為首個獲批的重組單鏈凝血因子Ⅷ產(chǎn)品。表1是對現(xiàn)階段處于已上市或臨床試驗階段的長效重組FⅧ藥物的比較。表2是對多種長效重組FⅧ藥物部分臨床試驗結(jié)果的比較。

3 FⅧ與vWF相互作用對延長FⅧ半衰期的影響

vWF是由內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白，在止血過程中發(fā)揮著重要的作用[34]。vWF是FⅧ體內(nèi)的天然結(jié)合載體，F(xiàn)Ⅷ分泌到血液后，會與vWF結(jié)合，以FⅧ/vWF復(fù)合物的形式進(jìn)行血液循環(huán)[35]，調(diào)節(jié)血小板凝聚以及血液凝塊的形成。FⅧ與vWF的結(jié)合對于FⅧ在血液循環(huán)過程中的穩(wěn)定是至關(guān)重要的。

FⅧ與vWF間具有很高的親和力，vWF與FⅧ的結(jié)合位點(diǎn)位于輕鏈上，與 FⅧ的a3、C1和 C2結(jié)構(gòu)域相互作用[35-37]。vWF與hFⅧ蛋白輕鏈的相互作用既能增強(qiáng)hFⅧ蛋白輕鏈和重鏈的結(jié)合[38]，也增強(qiáng)了FⅧ的穩(wěn)定性和延長hFⅧ半衰期約2–12 h：一方面 vWF結(jié)合的 hFⅧ不能與磷脂和血小板結(jié)合而延長了hFⅧ在血漿中的時間；另一方面由于FⅧ/vWF復(fù)合物的形成隱藏了位于hFⅧ輕鏈上的蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)，從而使 FⅧ免受凝血酶以外的蛋白酶降解[35]。

臨床研究表明，血管性血友?、裥突颌笮突颊叩腇Ⅷ水平會隨著血液中vWF的減少而降低，而血管性血友病2N型患者由于vWF基因的突變而干擾了 FⅧ與 vWF的結(jié)合，雖然患者體內(nèi)的vWF水平正常，但是FⅧ的水平卻顯著降低。通過將 HA患者的血漿輸入到一些血管性血友病患者體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這些血管性血友病患者的FⅧ水平有所恢復(fù)，這是由于輸入的血液中vWF補(bǔ)充了患者體內(nèi)缺失的vWF，增加了患者FⅧ在血液中的穩(wěn)定性，表明外源的vWF能夠穩(wěn)定內(nèi)源的FⅧ。同樣的，利用外源重組 FⅧ治療 HA患者，患者體內(nèi)的vWF也能夠與外源重組FⅧ相互作用，增加重組 FⅧ在血液中的穩(wěn)定性，從而也能夠達(dá)到穩(wěn)定血液中FⅧ水平的作用[39]。

表2 長效重組FⅧ藥物部分臨床試驗結(jié)果Table 2 Results from clinical trial programs of half-life extended factor Ⅷ products

vWF除了在體內(nèi)能夠起到穩(wěn)定FⅧ半衰期的作用外，在體外也起到了延長FⅧ半衰期的作用。筆者所在單位上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所利用動物乳腺生物反應(yīng)器在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中實現(xiàn)了FⅧ與vWF的共表達(dá)，實驗結(jié)果表明，在相同條件下，共表達(dá)vWF的FⅧ轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中FⅧ比單獨(dú)表達(dá) FⅧ的轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中 FⅧ的體外半衰期延長了約1倍[40]。

3.1 FⅧ/vWF復(fù)合物的清除

人和動物實驗表明vWF的缺失會導(dǎo)致FⅧ的半衰期降低6倍，而FⅧ的存在并沒有影響vWF的半衰期。這一結(jié)果與大部分FⅧ和vWF結(jié)合并被清除的觀點(diǎn)相一致，進(jìn)一步表明了vWF能夠保護(hù)FⅧ免受最初的降解。FⅧ的清除速率直接影響著FⅧ的穩(wěn)定性和半衰期。因為FⅧ/vWF以復(fù)合物形式進(jìn)行血液循環(huán)，評價 FⅧ在血液中的清除過程就變得比較復(fù)雜。直至今日，人們?nèi)匀粵]有探明 FⅧ和 vWF這兩個蛋白在血液中的清除機(jī)理。但有一點(diǎn)是毋庸置疑的，即影響vWF清除率的因素會直接或者間接影響 FⅧ的清除率。vWF和 FⅧ具有一些共同的清除受體，這些受體既可以與FⅧ結(jié)合，也可以與vWF結(jié)合，如LRP1[41]、ASGPR[42]、Siglec-5[43]和 STAB2[1]等。研究還發(fā)現(xiàn)在體外vWF的存在常常會影響FⅧ與其適合受體 (LRP1，ASGPR，Siglec-5) 的結(jié)合。但這并不代表 FⅧ不能夠與這些受體單獨(dú)發(fā)生作用。vWF與 FⅧ的相互作用是高度動態(tài)變化的，二者具有很高的結(jié)合和解離速率。這個動態(tài)平衡表明 FⅧ會頻繁地與vWF解離，使得FⅧ可以從一個vWF分子移動到另一個vWF分子。

3.2 半衰期延長的rFⅧ與vWF的作用

臨床前和臨床試驗研究均發(fā)現(xiàn) PEG修飾的rFⅧ、rFⅧFc和單鏈結(jié)構(gòu)的rFⅧ仍需要與內(nèi)源性的vWF相互作用，并受到該相互作用的調(diào)控，rFⅧ大部分以FⅧ/vWF復(fù)合物的形式被清除，因此vWF對長效型rFⅧ的穩(wěn)定性具有重要作用。

3.2.1 PEG修飾rFⅧ

與FⅧ相比，PEG化的長效rFⅧ半衰期延長到1.5倍左右。臨床前研究表明FⅧ和vWF的相互作用對 PEG修飾 FⅧ半衰期的延長作出了貢獻(xiàn)。Tang等突變了FⅧ (PEG化的B結(jié)構(gòu)域缺失的FⅧ，PEG-FⅧ-BDD) 與vWF結(jié)合的結(jié)構(gòu)域獲得PEG-F8V，發(fā)現(xiàn)在HA小鼠和大鼠體內(nèi)PEG-F8V的半衰期與PEG-FⅧ-BDD相比均降低了1倍[39]。

3.2.2 rFⅧFc

在vWF敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)，rFⅧFc的半衰期與rFⅧ相比延長了5倍，而當(dāng)vWF存在時，rFⅧFc的半衰期與rFⅧ相比僅延長了1.8倍，vWF的清除導(dǎo)致了與其結(jié)合的rFⅧFc的清除[44]。此外，臨床研究發(fā)現(xiàn)vWF的水平與rFⅧFc的清除存在很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性[16,45]，當(dāng)內(nèi)源性 vWF水平增加時，rFⅧFc表現(xiàn)出清除率降低，半衰期延長。

3.2.3 單鏈結(jié)構(gòu)rFⅧ

單鏈結(jié)構(gòu)rFⅧ能夠有效避免FⅧ兩條鏈的自發(fā)解離，從而改善 FⅧ的穩(wěn)定性。Sabine等制備的單鏈結(jié)構(gòu)FⅧ (rⅧ-single chain, CSL627) 使其在體內(nèi)的半衰期與 FⅧ相比延長了 1倍，原因在于相比于rFⅧ，rⅧ-single chain與vWF的親和力增加了3倍，只有一小部分未與vWF結(jié)合的游離rFⅧ被迅速清除[11]。該藥物動力學(xué)現(xiàn)象在最近的臨床實驗中被進(jìn)一步重復(fù)和證實[46]。

4 未來長效rFⅧ研發(fā)的策略

目前，研發(fā)的長效rFⅧ制品在后期臨床研究中與 FⅧ相比僅在一定程度上延長了 FⅧ的半衰期。越來越多的研究表明，vWF的半衰期 (約15 h) 是FⅧ半衰期延長效果的關(guān)鍵限制因素，血漿中FⅧ的清除主要是通過vWF依賴的清除途徑進(jìn)行的。為了克服vWF依賴的限制，研究者通過以下兩種途徑進(jìn)行新策略的嘗試：一種是延長vWF的半衰期，另一種是限制FⅧ的vWF依賴的清除途徑。

Yee發(fā)現(xiàn)包含vWF的hFⅧ結(jié)合區(qū)域的截短型vWF 變體 D’D3區(qū)域 (764–1 247 aa) 是穩(wěn)定 hFⅧ的必需區(qū)域。Yee等又設(shè)計生產(chǎn)了與 Fc融合的D’D3 (D’D3-Fc)，使其能在體內(nèi)循環(huán)利用。研究發(fā)現(xiàn)，在 vWF缺陷的小鼠體內(nèi)，注射 D’D3-Fc能使內(nèi)源性凝血因子Ⅷ持續(xù)穩(wěn)定，較不注射D’D3-Fc的 vWF缺陷小鼠其血漿內(nèi)的 hFⅧ蛋白水平增長10倍，并能在注射后至少持續(xù)7 d。然而，在HA小鼠體內(nèi)共注射D’D3-Fc和rFⅧ卻沒能有效延長rFⅧ的半衰期。通過動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與D’D3或D’D3-Fc相比，內(nèi)源性的vWF與FⅧ具有更高的親和力[47]。Bendetowicz和Yee等的研究表明，vWF的N端前導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)以及C端的D3到 CK之間的片段對維持 FⅧ穩(wěn)定均發(fā)揮了作用[47-48]。基于Yee等的研究，筆者已采用全長vWF和Fc融合表達(dá)重組蛋白vWF-Fc來延長vWF的半衰期，以期望實現(xiàn)vWF-Fc在 HA小鼠體內(nèi)提高 FⅧ穩(wěn)定性和延長其半衰期的作用，同時有效克服內(nèi)源性vWF的競爭作用。此外，人血清白蛋白融合的 vWF (vWF-albumin) 已經(jīng)在哺乳動物細(xì)胞中得以表達(dá)，并在體內(nèi)顯示出了顯著的半衰期延長效果[49]。

另一種新的策略試圖繞過FⅧ依賴vWF的降解途徑，即通過制備一種新型rFⅧ分子，它由兩部分多肽組成：含有XTEN (一種親水性、非結(jié)構(gòu)化的多肽，可延長融合蛋白半衰期) 的B結(jié)構(gòu)域缺失的單鏈結(jié)構(gòu)FⅧ (BDD-FⅧ)，和vWF的D’D3結(jié)構(gòu)域。這些多肽與IgG1的Fc結(jié)構(gòu)域融合，以使D’D3結(jié)構(gòu)域能夠與FⅧ部分正確連接。該策略在動物模型中表現(xiàn)出了良好的藥代動力學(xué)，與BDD-FⅧ相比，它的半衰期延長了4倍[50]。

5 總結(jié)和展望

HA的主要治療和預(yù)防方法為rFⅧ替代療法，也是目前臨床上使用最為廣泛和安全的方法，而延長 FⅧ的半衰期和提高 FⅧ的穩(wěn)定性仍是替代療法最需要解決的問題之一。長效rFⅧ的開發(fā)一方面可以解決 FⅧ半衰期短的問題，另一方面也可以減少患者用藥量，改善目前 FⅧ藥物緊缺的現(xiàn)狀。因此，長效rFⅧ的開發(fā)蘊(yùn)藏著巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。令人欣喜的是在過去的幾年里已有3種長效rFⅧ藥物上市，多種長效rFⅧ制品正處于不同的臨床試驗階段，它們已經(jīng)成功地將 FⅧ的半衰期延長到內(nèi)源FⅧ半衰期的1.4–2.0倍，在一定程度上改善了HA替代療法，緩解了HA患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)壓力，大幅提高了HA患者的生活質(zhì)量。目前，我國長效型rFⅧ制品的研究還基本處于起步階段，因此，我國科研工作者應(yīng)該加強(qiáng)新型長效型凝血因子藥物的研發(fā)，爭取在未來凝血因子藥物市場獲得一席之地。

隨著對長效rFⅧ制品機(jī)理的深入研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Ⅷ半衰期的延長仍有很大的提升空間。已有的臨床前和臨床試驗結(jié)果表明，目前制約長效型rFⅧ半衰期的主要限制因素在于內(nèi)源 vWF與 rFⅧ的相互作用。因此，未來長效型rFⅧ研發(fā)的重點(diǎn)是更加深入了解FⅧ和vWF相互作用及其復(fù)合物的分解代謝途徑。隨著將來對FⅧ和vWF之間關(guān)系的進(jìn)一步認(rèn)識，結(jié)合生物技術(shù)的不斷創(chuàng)新，延長rFⅧ半衰期將會有更好的解決方法，從而改善HA的治療并造福HA患者。

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