卡他莫拉菌UspA1蛋白多克隆抗體的制備及鑒定

王輝，楊波，趙可勝，李家吉，李新，孔萌萌，宮春杰，王毅，陶冶，張秋，胡征

湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068

卡他莫拉菌 (Moraxella catarrhalis,Mc) 由Kirchner首次分離于1890年，當(dāng)時(shí)稱之為卡他微球菌Micrococcus catarrhalis[1]，之后又稱為卡他奈瑟菌Neisseria catarrhalis和卡他布蘭漢菌Branhamella catarhalis。最初被認(rèn)為是對人體無致病性的上呼吸道正常寄居菌，后來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，該菌不僅可以引起兒童和老年人的上呼吸道感染，而且還是引起兒童上頜竇炎、中耳炎、肺炎以及成人的慢性下呼吸道感染的最常見致病菌[2-6]。因多數(shù)分離株具有 β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性[7-16]，所以需要確診后再選擇合適的治療方案。但臨床上該菌與其他呼吸道病原體引起的感染癥狀類似，因此常難以根據(jù)臨床表現(xiàn)、X-射線檢查等得出結(jié)論，確診往往依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷。由于兒童疾病起病急、轉(zhuǎn)歸快的特點(diǎn)，要求建立基于抗原的敏感、快速、實(shí)用的病原體檢測方法，因此尋找制備方法簡便、特異性高的針對性抗體具有重要意義。

普遍存在的表面蛋白 (Ubiquitous surface protein A，UspA) 又稱為高分子量外膜蛋白，是Mc外膜蛋白中研究較成熟的蛋白。1994年，Helminen等[17]發(fā)現(xiàn)M. catarrhalisO35E菌株UspA蛋白表面暴露區(qū)存在單克隆抗體 (MAb 17C7)識(shí)別位點(diǎn)。此后，該蛋白被廣泛報(bào)道。1997年，Aebi等[18]發(fā)現(xiàn) UspA蛋白包括 2種蛋白分子，uspa1編碼蛋白的UspA1 (88 kDa) 和uspa2編碼的UspA2 (62 kDa)。兩者均含MAb 17C7識(shí)別位點(diǎn)，分別存在相似性達(dá) 93%的氨基酸序列片段(由140個(gè)氨基酸組成)。1998年，Aebi等[19]證明UspA1蛋白在Mc黏附到上皮細(xì)胞過程中起作用，而 UspA2蛋白存在時(shí)宿主血清殺菌能力受到限制。Mcmichael等[20]報(bào)道，UspA1和UspA2為不同的毒力功能服務(wù)，但都有很好的免疫原性和反應(yīng)原性。Chen等[21]報(bào)道抗UspA1抗體和抗UspA2抗體有交叉反應(yīng)，兩者都與免疫血清的殺菌活性有關(guān)。Lafontaine等[22]發(fā)現(xiàn)UspA1蛋白和由基因uspA2H編碼的UspA2H蛋白共同調(diào)節(jié)Mc對人上皮細(xì)胞的黏附。Meier等[23]報(bào)道外膜蛋白 UspA1和 UspA2在幼兒咽炎分離株中高度保守。Hays等[24]認(rèn)為UspA1和UspA2可作為疫苗候選抗原。Murphy等[25]認(rèn)為UspA1和UspA2可作為抗體的靶標(biāo)。由此可見，UspA1和UspA2具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，可用于抗體的制備。

然而，該蛋白在卡他莫拉菌內(nèi)表達(dá)量較少，提取天然蛋白后制備抗體存在困難。目前，國內(nèi)外未見用 UspA1重組蛋白制備多克隆抗體的報(bào)道。本研究通過對UspA1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲取了胞外結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段，并對其密碼子進(jìn)行原核優(yōu)化后獲得了經(jīng)修飾的uspa1基因。通過全基因合成和分子克隆技術(shù)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-uspa1，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)及純化獲得重組蛋白 UspA1-His，進(jìn)一步免疫新西蘭大白兔制備了抗 UspA1蛋白 PcAb，為進(jìn)一步建立卡他莫拉菌快速檢測技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

卡他莫拉菌ATCC 25238 購自ATCC?？寺∷拗骶鶨. coli Top 10、表達(dá)宿主菌E. coli Rosetta(DE3)、表達(dá)載體 pET-28a(+)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。新西蘭大白兔由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 主要試劑

核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NdeⅠ、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒DNA小量試劑盒、膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司。96孔板、羊抗兔IgG-HRP、TMB、硝酸纖維素膜、聚偏二氟乙烯膜 (PVDF) 購自武漢博士德生物工程有限公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司。羧基水溶性量子點(diǎn) (12?18 nm) 購自武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司。組氨酸親和預(yù)裝柱、Protein A親和預(yù)裝柱為GE healthcare公司產(chǎn)品。

1.3 uspa1基因克隆與重組表達(dá)載體 pET-28auspa1的構(gòu)建

對天然Mc表面蛋白 UspA1 (GenBank accession number為AAF36416) 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲取其胞外保守結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段 (522?710 aa)，找到其對應(yīng)的DNA編碼序列，引入大腸桿菌偏好性密碼子，優(yōu)化后在其5′引入酶切位點(diǎn)NdeⅠ、3′端引入終止信號(hào) TAA和酶切位點(diǎn)XhoⅠ后化學(xué)合成全基因序列 (圖1)，記為uspa1(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成后連于載體 pUC57-Sample上)。將質(zhì)粒pUC57-Sample-uspa1和載體pET-28a(+)雙酶切回收后進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli Top 10感受態(tài)細(xì)胞中，用卡那霉素抗性平板和酶切鑒定篩選陽性單克隆進(jìn)行測序。選擇測序未突變且讀碼框正確的重組原核表達(dá)載體pET-28a-uspa1。

1.4 融合蛋白UspA1-His的表達(dá)、可溶性分析及純化

將重組載體 pET-28a-uspa1和空載體pET-28a(+)分別轉(zhuǎn)入到E. coli Rosetta(DE3) 表達(dá)菌中，挑取單菌落加入到100 mL含有硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，220 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，取1 mL接入1 L含有硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，220 r/min、37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6，加入 IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心收集菌體。菌體經(jīng)超聲裂解后，12 000 r/min離心15 min，收集上清。上清進(jìn)行親和層析純化，得到重組蛋白。

圖1 uspa1核苷酸基因全序列Fig. 1 The whole genome sequence of uspa1. The underlined sequences are recognition sites of restriction endonuclease.

1.5 抗UspA1-His融合蛋白PcAb的制備及純化

將上述純化的重組UspA1-His融合蛋白稀釋后，按照200 μg (1 mL) 與1 mL弗氏完全佐劑混勻乳化后免疫2只雄性新西蘭大白兔，于背部皮下多點(diǎn)注射。間隔7 d后再免疫1次，再過14 d后用上述純化的重組 UspA1-His融合蛋白按照200 μg (1 mL) 與1 mL弗氏不完全佐劑混勻乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫7 d后，再按上述同樣方法再加強(qiáng)免疫一次。7 d后取血以UspA1-His包被酶標(biāo)板，間接ELISA法測定效價(jià)。若效價(jià)大于 1×105，則心臟采血，分離血清，否則需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫。以A蛋白親和層析預(yù)裝柱純化PcAb IgG，用A280測定抗體濃度，并用磷酸鹽緩沖液調(diào)整為1 mg/mL，–20 ℃保藏備用。

1.6 抗UspA1-His融合蛋白PcAb的效價(jià)測定

用間接ELISA方法測定抗UspA1-His融合蛋白PcAb效價(jià)。以4 μg/mL的UspA1-His包被酶標(biāo)板 (100 μL/孔)，37 ℃恒溫孵育 1 h，經(jīng)洗滌、封閉后，加入100 μL倍比稀釋的抗UspA1-His融合蛋白PcA，初始濃度為10 μg/mL。以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG (HRP-IgG) 為二抗進(jìn)行測定。陰性參照以免疫前血清代替一抗。根據(jù)450 nm處吸光值 (OD450) 判斷結(jié)果。判定方法，S/N=(待檢OD450) / (陰性對照OD450)。S/N>2.1為陽性。以S/N>2.1所對應(yīng)的抗體最高稀釋倍數(shù)作為該抗體的效價(jià)。

1.7 抗UspA1-His融合蛋白PcAb鑒定

1.7.1 Western blotting方法鑒定

利用Western blotting鑒定抗UspA1-His融合蛋白PcAb對天然Mc的識(shí)別能力。將Mc超聲破胞上清及 UspA1-His融合蛋白處理后進(jìn)行 SDSPAGE分析。經(jīng)轉(zhuǎn)膜、干燥、封閉后，加入待檢多抗，以HRP-IgG為二抗進(jìn)行反應(yīng)。清洗后，以超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物混合物完全覆蓋印跡膜2–3 min，超靈敏多功能成像儀下獲取膠片。

1.7.2 免疫熒光方法鑒定

利用直接免疫熒光法，鑒定UspA1-His融合蛋白PcAb對Mc抗原的識(shí)別能力。首先用可溶性羧基量子點(diǎn)標(biāo)記抗UspA1-His融合蛋白PcAb (按說明書操作)，經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳后紫外光下觀察標(biāo)記效果。再以該標(biāo)記抗體作為特異性熒光抗體，將其滴加于固定有Mc菌液的載玻片上，用水洗去多余未參加反應(yīng)的熒光抗體。干燥后用超分辨熒光顯微鏡觀察Mc菌體與量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的結(jié)合情況。

1.7.3 間接ELISA方法鑒定

利用間接ELISA法，測定UspA1-His融合蛋白 PcAb對Mc抗原的識(shí)別能力。以Mc菌液(OD460=0.504) 包被酶標(biāo)板，封閉后加入100 ng/mL的待檢抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG (HRP-IgG) 為二抗進(jìn)行測定。陰性參照以待檢抗體緩沖液為一抗，陽性參照包被 UspA1-His融合蛋白。根據(jù)450 nm處吸光值 (OD450) 判斷結(jié)果。判定方法：S/N= (待檢OD450) / (陰性對照OD450)。S/N>2.1為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 uspa1基因克隆與重組表達(dá)載體pET-28a-uspa1的構(gòu)建

如圖 2A中顯示，通過雙酶切方法，從質(zhì)粒pUC57-Sample-uspa1中獲得大小為570 bp的目的片段，重組質(zhì)粒pET-28a-uspa1經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，出現(xiàn)大小與目的片段一致的條帶(圖2B)?；驕y序結(jié)果正確。

2.2 融合蛋白UspA1-His表達(dá)與純化

對含質(zhì)粒 pET-28a-uspa1的重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在24 kDa處誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白 (圖3A)。超聲裂解后在上清和沉淀中均含有目的蛋白。取誘導(dǎo)表達(dá)上清用鎳柱進(jìn)行純化，得到純化的UspA1-His。以A280測定蛋白濃度為 0.4 mg/mL(圖 3B)。

2.3 抗UspA1-His融合蛋白PcAb的制備及純化

兔子經(jīng) 4次免疫后，以間接 ELISA測定血清中抗體的效價(jià)可達(dá)到 1∶512 000以上，經(jīng) A蛋白親和層析純化后最終可獲得450 mg的特異性抗體。

圖2 uspa1基因克隆與重組表達(dá)載體pET-28a-uspa1的構(gòu)建Fig. 2 Cloning of uspa1 gene and construction of its recombinant expression vector pET-28a-uspa1. (A) Digestion of pET-28a and pUC57-Sample-uspa1 plasmid with restriction enzyme NdeⅠ and XhoⅠ. (B) Digestion of pET-28a-uspa1 plasmid with restriction enzyme NdeⅠand XhoⅠ.

2.4 間接ELISA測定抗UspA1-His融合蛋白PcAb的效價(jià)

抗UspA1-His融合蛋白 PcAb的效價(jià)測定結(jié)果 (圖4) 顯示，當(dāng)用倍比稀釋法將待檢抗體稀釋512 000倍時(shí)，S/N=2.69>2.1，為陽性結(jié)果。若繼續(xù)稀釋，S/N將小于2.1，因此所得抗體的效價(jià)為1∶512 000。

圖3 UspA1-His蛋白的表達(dá)與純化Fig. 3 Expression and purification of recombinant protein UspA1. (A) Expression of recombinant protein UspA1. M: protein marker; lane 1: UspA1-His before expression; lane 2: UspA1-His after expression; lane 3:supernatant after ultrasonication; lane 4: precipitation after ultrasonication. (B) Purification of recombinant protein UspA1-His. M: protein marker; lane 1: flow-through solution; lane 2: elution buffer with 10 mmol/L glyoxaline;lane 3: elution buffer with 20 mmol/L glyoxaline; lane 4:elution buffer with 40 mmol/L glyoxaline; 5: elution buffer with 100 mmol/L glyoxaline; lane 6: elution buffer with 150 mmol/L glyoxaline.

2.5 抗UspA1-His融合蛋白PcAb鑒定

2.5.1 Western blotting方法鑒定

Western blotting鑒定抗體結(jié)果見圖5，泳道1中出現(xiàn)條帶，表明抗 UspA1-His PcAb能夠識(shí)別UspA1-His融合蛋白。泳道2中72–95 kDa之間出現(xiàn)的條帶與UspA1 (88 kDa) 分子量大小相符，表明抗UspA1-His融合蛋白PcAb能夠識(shí)別Mc表面蛋白UspA1。

圖 4 間接 ELISA方法檢測抗 UspA1-His融合蛋白PcAb效價(jià)Fig. 4 The titer assay of the PcAb against recombinant protein UspA1-His.

圖 5 Western blotting鑒定抗 UspA1-His融合蛋白PcAbFig. 5 Identification of the PcAb against recombinant protein UspA1-His by Western blotting. M: protein marker; lane 1: recombinant protein UspA1-His; lane 2:supernatant of Mc after ultrasonication.

2.5.2 免疫熒光方法鑒定

用可溶性羧基量子點(diǎn)標(biāo)記抗UspA1-His融合蛋白 PcAb，1%瓊脂糖凝膠電泳后紫外光下鑒定結(jié)果見圖 6A。結(jié)果顯示，標(biāo)記了抗體的量子點(diǎn)比未標(biāo)記抗體的量子點(diǎn)分子量大，說明抗體標(biāo)記成功。量子點(diǎn)標(biāo)記抗體與Mc菌體反應(yīng)后，超分辨熒光顯微鏡下觀察結(jié)果見圖6B。結(jié)果顯示，視野中可觀察到紅色亮點(diǎn)，說明量子點(diǎn)標(biāo)記PcAb能夠識(shí)別Mc表面蛋白UspA1的胞外暴露區(qū)。

圖6 免疫熒光法鑒定Fig. 6 Identification by direct immunofluorescence. (A)Detection of the labelled PcAb. Lane 1: the unlabelled PcAb; lane 2: the labelled PcAb. (B) The labelled PcAb’s recognition to Mc.

2.5.3 間接ELISA方法鑒定

間接 ELISA 法鑒定抗體結(jié)果顯示，S/N=46.701>2.1，結(jié)果為陽性，說明待檢抗UspA1-His融合蛋白PcAb能有效識(shí)別Mc表面蛋白UspA1的胞外暴露區(qū)。該結(jié)果與2.5.2中免疫熒光鑒定結(jié)果一致。

3 討論

本研究對卡他莫拉菌UspA1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲取了其胞外保守結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段 (522?710 aa)，避免了多余肽段的無效表達(dá)，提高了重組抗原的有效性。密碼子優(yōu)化協(xié)調(diào)是進(jìn)行蛋白質(zhì)異源系統(tǒng)表達(dá)常用的手段。本文對uspa1基因進(jìn)行原核密碼子優(yōu)化后，獲得了可溶性表達(dá)的目的蛋白。重組表達(dá)的小分子蛋白免疫原性強(qiáng)，免疫后所得多克隆抗體量大、親和力高。本文用800 μg表達(dá)的重組蛋白UspA1-His免疫新西蘭兔，經(jīng)4次免疫后得到總量450 mg的多克隆抗體，效價(jià)可達(dá)1∶512 000。

Ackermann等[26]研究發(fā)現(xiàn)UspA1作為Oca家族成員，其保守功能域(742?832 aa)與 YadA、EibA、Hia等多個(gè)蛋白的相關(guān)結(jié)構(gòu)域在三維結(jié)構(gòu)上高度相似，但氨基酸序列一致性很低 (最高為10.99%)，因此本文依據(jù)該保守結(jié)構(gòu)域及其附近區(qū)域 (522?710 aa) 制備的多克隆抗體可保證其特異性。

本研究所制備的抗卡他莫拉菌表面蛋白UspA1胞外結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體不僅能識(shí)別UspA1-His重組蛋白，而且可識(shí)別Mc表面蛋白UspA1的胞外暴露區(qū)。該研究為進(jìn)一步建立基于抗原的卡他莫拉菌快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

目前，正在利用該表面暴露區(qū)制備相應(yīng)的單克隆抗體。單克隆抗體制備完成后將與該多克隆抗體進(jìn)行配對，制備基于量子點(diǎn)免疫層析的檢測試劑盒。

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