陳 晴,馬倩倩,沈振華,李二超,陳立僑
(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200241)
魚粉作為水產(chǎn)飼料中至關(guān)重要的蛋白源,具有蛋白含量高、氨基酸平衡等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)全球范圍內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)對(duì)魚粉的需求量不斷提高,其價(jià)格隨之升高,以適當(dāng)?shù)闹参锏鞍自刺娲~粉已經(jīng)成為水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究學(xué)者們關(guān)注的重要課題[1-3]。植物蛋白源來(lái)源廣泛,價(jià)格相對(duì)較低,但存在多種不同抗?fàn)I養(yǎng)因子,且某些必需氨基酸比例失衡,數(shù)量偏低[4],替代比例過高會(huì)導(dǎo)致飼料適口性差、消化率和蛋白質(zhì)效率的下降,影響水生動(dòng)物的攝食和生長(zhǎng)[5-7],降低產(chǎn)品的質(zhì)量。為了提高植物蛋白源替代魚粉的效率,往往需要額外添加必需氨基酸和(或)其它有效成分,如膽汁酸、?;撬岬葋?lái)提高對(duì)植物蛋白源飼料的利用率。
蛋氨酸是水生動(dòng)物生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的含硫氨基酸,它直接參與蛋白質(zhì)的合成,作為主要甲基供體參與DNA和蛋白質(zhì)的甲基化作用,以及其它生理活性物質(zhì)合成的前體物質(zhì)。水產(chǎn)飼料中的植物蛋白源普遍缺少蛋氨酸[8-10],過量的植物蛋白會(huì)引起動(dòng)物食欲下降,生長(zhǎng)減慢。有研究表明,飼料中蛋氨酸明顯缺乏時(shí),會(huì)引起奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus)[11]體蛋白合成率下降,隨蛋氨酸水平的提高,體蛋白合成率則隨之增高;有學(xué)者發(fā)現(xiàn)合理補(bǔ)充蛋氨酸可以提高大黃魚 (Pseudosciaena crocea)[12]、日 本 囊 對(duì) 蝦(Marsupenaeus japonicus)[4]的生長(zhǎng)率和肌肉的比例[13]。
?;撬崾且环N含硫氨基酸,具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),參與多種機(jī)體正常生理功能的調(diào)節(jié)[14-16],但幾乎所有植物蛋白源都缺乏?;撬幔?][17]。?;撬嵩诰S持高等動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)、結(jié)合膽汁酸、繁殖和免疫功能等方面均有重要作用[18-20]。不同種類魚合成?;撬岬哪芰τ兴煌?1],其中肉食性魚類自身合成?;撬岬哪芰κ禽^差的,如果飼料中也缺乏?;撬?,機(jī)體會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)不良等癥狀,而在?;撬岬玫胶侠硌a(bǔ)充之后魚類的生長(zhǎng)性能可得到改善[22]。
膽汁酸是一種存在于膽汁中的類固醇酸,是膽汁的重要組成成分,能促進(jìn)脂肪吸收和蛋白質(zhì)消化利用,同時(shí)還具有一定的殺菌作用。有研究表明膽汁酸能夠促進(jìn)大菱鲆(Scophthalmus maximus)[23]和鯉(Cyprinus flammans)[24]等魚類的生長(zhǎng)。由于蝦、蟹類沒有膽囊,機(jī)體無(wú)法分泌膽汁和形成膽汁酸,雖有初步實(shí)驗(yàn)表明適量的膽汁酸制劑對(duì)羅氏沼蝦(Macrobrachiumro senbergii)具有促生長(zhǎng)作用[25],但迄今該方面尚沒有較為完整和深入的報(bào)道。
中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)在我國(guó)的淡水漁業(yè)中占有重要的地位。有研究表明,其配合飼料中過度使用植物蛋白替代魚粉會(huì)引起氨基酸比例失衡,缺乏促生長(zhǎng)因子,導(dǎo)致飼料適口性差,攝食和生長(zhǎng)下降等問題[17,26-27],但尚未見在高比例植物蛋白飼料中補(bǔ)充生理活性物質(zhì)以提高飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的報(bào)道。本研究以40%的棉粕為主要蛋白源,探討了外源補(bǔ)充蛋氨酸、膽汁酸和?;撬釋?duì)幼蟹生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的影響,以期為提高植物蛋白源的利用率,完善中華絨螯蟹的人工飼料配方提供參考。
本實(shí)驗(yàn)以棉粕為主(棉粕占40%)的植物蛋白和15%魚粉為蛋白源、魚油和豆油(1∶1)為脂肪源配制低魚粉基礎(chǔ)飼料(表1)。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn),在低魚粉基礎(chǔ)飼料中分別添加0.5%蛋氨酸(Met),0.5%、1.0%膽汁酸(Bile),0.5%、1.0%牛磺酸(Taurine)作為實(shí)驗(yàn)飼料為5個(gè)試驗(yàn)處理組,并以基礎(chǔ)飼料中不使用添加劑的低魚粉組(魚粉占15%,記為L(zhǎng)FM)和全魚粉組(魚粉占64.4%,記為FM)為對(duì)照,按等氮等能的原則配制成共7組飼料。原料經(jīng)粉碎過80目篩,經(jīng)準(zhǔn)確稱重后按照逐級(jí)放大的原則混勻,加入油源和適量的水混合均勻,用F-26雙螺桿擠條機(jī)(華東理工大學(xué)科技實(shí)業(yè)總廠,中國(guó))加工成直徑1 mm的顆粒,室溫風(fēng)干至水分小于10%時(shí),保存在-20℃冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)飼料配方見表1。
實(shí)驗(yàn)用幼蟹采購(gòu)自上海崇明養(yǎng)殖場(chǎng)。幼蟹經(jīng)過一周的暫養(yǎng),隨機(jī)挑取規(guī)格相似,平均體重(0.26±0.02)g的個(gè)體用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)一共設(shè)置7個(gè)組(分別為2組對(duì)照和5組試驗(yàn)處理組),每組5個(gè)重復(fù),將選取的幼蟹隨機(jī)放入水族箱(規(guī)格為80 cm×60 cm×60 cm),每個(gè)重復(fù)30 ind蟹。每個(gè)水族箱中放置數(shù)片拱形瓦片為幼蟹提供棲息藏匿。養(yǎng)殖期間,進(jìn)行飽食投喂,每天上午8∶00和下午16∶30投喂2次,投喂前收集糞便,投喂2 h后回收殘餌。每天統(tǒng)計(jì)脫殼數(shù)和死亡情況,及時(shí)將死蟹取出并稱重。補(bǔ)充經(jīng)充分曝氣處理的養(yǎng)殖用水,每日換水1/3~1/2,養(yǎng)殖期間不間斷充氣,實(shí)驗(yàn)期間水溫為24.0~29.0℃,溶解氧 >7.0mg·L-1,總氮 <0.01 mg·L-1,pH為8.0±0.4,養(yǎng)殖周期為8周。
養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),禁食24 h后對(duì)每個(gè)水族箱的幼蟹稱重,然后統(tǒng)計(jì)幼蟹的存活數(shù)量。每個(gè)水族箱隨機(jī)選取5 ind蟹保存于-20℃冰箱,以用于體成分分析。剩余的蟹置于冰上麻醉后,用1 mL不含抗凝劑的注射器從第三足基部取血淋巴,4℃靜置過夜,5 000 r·min-1離心10 min后取血清保存于-80℃待測(cè)。取血后的蟹解剖取肝胰腺和腸道,保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>
表1 飼料配方組成及營(yíng)養(yǎng)成分Tab.1 Composition and nutrient content of experimental diets
1.3.1 體成分及飼料營(yíng)養(yǎng)成分和能量分析
全蟹及飼料的常規(guī)體組生化成分的分析,參考AOAC[28]的標(biāo)準(zhǔn)方法。水分測(cè)定采用105℃烘干至恒重法(24 h),粗蛋白含量測(cè)定采用凱氏定氮法(FOSS,Kjeltec2200,Denmark),粗脂肪測(cè)定采用索氏抽提法(FOSS,SoxtecTM 2043,Denmark),灰分測(cè)定采用馬弗爐灼燒法(550℃,14 h)。
飼料總能采用WELL9000型全自動(dòng)快速量熱儀(上海歐銳儀器設(shè)備有限公司)進(jìn)行測(cè)定。
1.3.2 抗氧化酶活性和丙二醛含量的測(cè)定
粗酶液的制備:準(zhǔn)確稱取肝胰腺或腸道,記重,按質(zhì)量體積比1∶9加入預(yù)冷磷酸緩沖液(PBS,pH 7.0,1.0 mol·L-1)制成 10%勻漿液,2 500 r·min-1離心10 min,取上清液待測(cè)。
超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。
超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定是采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測(cè)定。按照肝胰腺酶液的每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量記作一個(gè)SOD活力單位(U·mg-1)。過氧化氫酶(Catalase,CAT)的測(cè)定采用Pinho的過氧化氫法,其中:在溫度30℃、pH 8.0的條件下,每毫克蛋白每分鐘分解1 mol底物過氧化氫所需要的酶量記作1個(gè)酶活力單位(U·mg-1)。
丙二醛含量的測(cè)定采用TBA法,其原理是過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合,形成紅色產(chǎn)物,在532 nm處有最大吸收峰,從而推算MDA的量。蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[29]。
1.3.3 肝胰腺和腸道的淀粉酶,脂肪酶和總蛋白酶的測(cè)定
淀粉酶(AMS)以可溶性淀粉為底物,采用碘-淀粉法,在660 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。酶活力單位定義:100 mL酶液中的淀粉酶,在37℃、15 min水解5 mg淀粉為1個(gè)酶活力單位[30]。
脂肪酶(Lipase)和總蛋白酶(total protease)采用ELISA試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)測(cè)定。
生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算公式如下
存活率(Survival rate,%)=[(N0—Nt)/N0]×100%
增重率(Weight gain rate,%)=[(Wt—W0)/W0]×100%
特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate,%/d)=[(Ln Wt—Ln W0)/d]×100%
飼料系數(shù)(Feed conversion ratio)=IF/W
蛋白質(zhì)效率(Protein efficiency)=W/IN
其中,N0和Nt分別為實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)蟹的個(gè)數(shù);Wo和Wt分別為幼蟹初始和終末重量(g);W為蟹體總增重(g);IF為實(shí)驗(yàn)期間總攝食飼料干重(g);IN為實(shí)驗(yàn)期間總攝食飼料蛋白質(zhì)質(zhì)量(g);d為實(shí)驗(yàn)天數(shù)(56 d)。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示,先用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA),若存在顯著差異(P<0.05),則采用Duncan法進(jìn)行多重比較。
從表2可見,各個(gè)組幼蟹的存活率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。FM組和0.5%Met組的增重率及特定生長(zhǎng)率最高,顯著高于LFM組和其它各試驗(yàn)組。而LFM組的飼料系數(shù)則顯著高于FM和其它各試驗(yàn)組。FM組、0.5%Met組的蛋白質(zhì)效率顯著高于LFM組,但與1.0%Bile組、0.5%Tau組和1.0%Tau組無(wú)顯著性差異。
全蟹體成分各個(gè)組的水分、粗蛋白、灰分均無(wú)顯著性差異(表3);0.5%Met組的粗脂肪含量最高,與 FM組、0.5%Bile組、0.5%Tau組均無(wú)顯著性差異,LFM組、1.0%Bile組和 1.0%Tau組的粗脂肪含量較低。
肝胰腺消化酶LFM組的淀粉酶活性最高,顯著高于FM組和其它各試驗(yàn)組(表4);與之相對(duì)應(yīng)的是,F(xiàn)M組的總蛋白酶最高,顯著高于其它各試驗(yàn)組,與LFM組相比,0.5%Bile組的總蛋白酶顯著提高;0.5%Met組的脂肪酶活性最高,顯著高于其它組。
LFM組的腸道淀粉酶活性最高,顯著高于其它各組,相比之下,F(xiàn)M組和0.5%Met組的淀粉酶活性最低;FM組和0.5%Met組的腸總蛋白酶最高,顯著高于其它各組,0.5%Bile組次之,LFM組最低,與LFM組相比,0.5%Tau組有顯著的提高;0.5%Met組的脂肪酶活性最高,顯著高于其它各組,而LFM組的脂肪酶活性最低。
表2 補(bǔ)充蛋氨酸、膽汁酸和?;撬釋?duì)幼蟹生長(zhǎng)率和飼料利用率的影響Tab.2 G row th performance,feed utilization of E.sinensis fed w ith different experim ental diets for 8 weeks
表3 補(bǔ)充蛋氨酸、膽汁酸和?;撬釋?duì)幼蟹全蟹體成分的影響Tab.3 W hole body proximate com position(%)of E.sinensis fed w ith different experimental diets for 8 weeks(%)
幼蟹肝胰腺抗氧化指標(biāo),LFM組的丙二醛(MDA)含量最高,顯著高于其它各組(表5),而FM組的丙二醛含量最低;相應(yīng)地,F(xiàn)M組的超氧化物歧化酶(SOD)活性最高,與0.5%Met組無(wú)顯著性差異,該兩組均顯著高于其它各組,其中LFM組活性最低;FM組的過氧化氫酶(CAT)活性最高,LFM組最低,與LFM組相比,0.5%Met組、添加Bile和Tau的處理組過氧化氫酶活性均顯著性提高。
表4 補(bǔ)充蛋氨酸、膽汁酸、?;撬釋?duì)幼蟹肝胰腺及腸道消化酶活力的影響Tab.4 Specific activity of am ylase,lipase and total protease in hepatopancreas and intestines of E.sinensis fed w ith different experimental diets for 8 weeks
表5 補(bǔ)充蛋氨酸、膽汁酸、牛磺酸對(duì)幼蟹肝胰腺的SOD、CAT活性和MDA含量的影響Tab.5 Specific activity of superoxide dismutase(SOD),catalase(CAT)and malondialdehyde(MDA)content in hepatopancreas of E.sinensis fed w ith different experim ental diets for 8 weeks
本研究發(fā)現(xiàn),在利用高比例植物蛋白替代魚粉的飼料中補(bǔ)充適當(dāng)?shù)鞍彼岷螅@著提高了幼蟹的生長(zhǎng)率,表明蛋氨酸]能補(bǔ)充飼料中缺乏的必需氨基酸[12],為機(jī)體的蛋白質(zhì)合成及含硫化合物的代謝提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果與之前學(xué)者對(duì)鯉、印度鯉幼魚和尼羅羅非魚的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,即外源補(bǔ)充蛋氨酸可以顯著提高以上魚類的攝食率和生長(zhǎng)性能[31-33]。
有學(xué)者發(fā)現(xiàn)添加膽汁酸能顯著提高羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)的增重率和成活率[25],但與日本囊對(duì)蝦(Seriolaquinquera diata)的研究相似,外源添加膽汁酸未能表現(xiàn)出明顯促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)的效果[34]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,補(bǔ)充膽汁酸雖未能顯著提高幼蟹的增重率,但可以顯著提高飼料效率。類似地,有研究表明飼料中添加膽汁酸能夠有效提高牛蛙(Rana Catesbelana)飼料效率[35],還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)膽汁酸可以刺激大馬哈魚(Oncorhynchus keta)的嗅覺,起到誘食劑的作用[36],本實(shí)驗(yàn)也觀察到添加膽汁酸能促進(jìn)幼蟹的攝食,為膽汁酸可以刺激動(dòng)物的嗅覺系統(tǒng)而促進(jìn)攝食提供了依據(jù)[37-38]。
外源補(bǔ)充?;撬嵛茨苡行Ц纳朴仔返脑鲋芈屎偷鞍踪|(zhì)效率,原因可能與飼料中魚粉含量偏低而導(dǎo)致一些主要限制性氨基酸(如蛋氨酸、賴氨酸等)不足有關(guān),提示在必需氨基酸受限的情況下,補(bǔ)充?;撬岵荒苡行Т龠M(jìn)機(jī)體的蛋白質(zhì)合成代謝、提高生長(zhǎng)率[39]。類似地,飼料中添加0.2%和0.45%以上的牛磺酸,均未能有效提高軍曹魚(Rachycentron canadum)和黑鱸(Lates calcarifer)的增重率[40-41];邱小琮等[42]研究則表明,當(dāng)飼料中?;撬崽砑恿窟^高(1 800 mg·kg-1)時(shí),草魚的生長(zhǎng)受到了抑制。由此可見,飼料中氨基酸受限時(shí),?;撬岵荒芴娲鷻C(jī)體蛋白質(zhì)合成所需的必需氨基酸發(fā)揮作用。牛磺酸作為條件必需氨基酸,其生理活性的發(fā)揮與基礎(chǔ)飼料中氨基酸數(shù)量和質(zhì)量之間的關(guān)系,尚需進(jìn)一步深入研究。
與全魚粉組相比較,低魚粉組的全蟹粗脂肪含量明顯降低,而補(bǔ)充蛋氨酸組則有明顯提高。補(bǔ)充0.5%膽汁酸組和0.5%?;撬岷?,全蟹粗蛋白和粗脂均沒有受到顯著的影響,這與對(duì)銀鱈(Anoplopoma fimbria)[3]的研究所得到的結(jié)果相類似。當(dāng)膽汁酸和?;撬岬奶砑恿吭龅?.0%時(shí),全蟹粗脂肪含量有所下降,可能原因是膽汁酸和牛磺酸具有降脂作用,其中?;撬徇€具有促進(jìn)脂肪酸氧化和減少脂肪合成的作用[43]。如何在飼料中補(bǔ)充適宜的膽汁酸、?;撬幔蕴岣咧腥A絨螯蟹對(duì)脂肪的利用效率和節(jié)約蛋白,值得進(jìn)一步探討。
甲殼動(dòng)物的消化酶活性也受飼料營(yíng)養(yǎng)素的影響,當(dāng)機(jī)體攝入足夠的氨基酸時(shí),消化腺能夠更順利合成消化酶[44],本研究發(fā)現(xiàn),外源補(bǔ)充蛋氨酸顯著提高了幼蟹肝胰腺和腸道總蛋白酶和脂肪酶的活性,但當(dāng)飼料中限制性氨基酸含量不足時(shí),則會(huì)影響機(jī)體的蛋白質(zhì)合成,本研究中添加膽汁酸組未能有效提高幼蟹消化酶活力的結(jié)果可得到初步的驗(yàn)證。有研究表明蟹胃液中沒有分離提純得到膽汁酸和膽汁醇,其具有表面張力和乳化能力的復(fù)合物質(zhì)由脂肪酸、?;撬岷图“彼峤M成[45]。迄今尚沒有證據(jù)表明中華絨螯蟹固有的消化途徑可不經(jīng)過膽汁酸參與,然而膽汁酸的化學(xué)構(gòu)型上具有親水和疏水的兩個(gè)方面,這樣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使膽汁酸具有較強(qiáng)的界面活性,能夠降低油/水兩相間的表面張力,促進(jìn)脂類乳化。外源補(bǔ)充的膽汁酸是否參與了乳化脂肪及促進(jìn)脂肪的乳化、吸收利用還不清楚。
從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,補(bǔ)充?;撬岷?,幼蟹腸道脂肪酶活性顯著增高。對(duì)黃河鯉(Cyprinus carpio)[46]和鯛(Pagrusmajor)[3]的研究也發(fā)現(xiàn),牛磺酸能夠激活脂肪酶活性。說明?;撬崮軌騾⑴c脂肪吸收利用的過程,但關(guān)于蝦、蟹類?;撬岬拇x過程知之甚少,尚無(wú)相關(guān)的詳細(xì)報(bào)道。
在本實(shí)驗(yàn)中,補(bǔ)充蛋氨酸實(shí)驗(yàn)組幼蟹的丙二醛含量低于低魚粉組,SOD活性和CAT活性則顯著高于低魚粉組,提示補(bǔ)充適量蛋氨酸可以提高幼蟹的抗氧化能力,這與對(duì)鯉[47]的研究結(jié)果是一致的,可能是因?yàn)闄C(jī)體內(nèi)蛋氨酸代謝生成的半胱氨酸,它繼而參與抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽的合成,恰恰還原型谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)主要的溶解性抗氧化劑,從而增強(qiáng)了機(jī)體抗氧化能力。
實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),膽汁酸的添加提高了幼蟹的抗氧化能力,有可能是通過提高肝細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和巰基蛋白水平,保護(hù)肝細(xì)胞,避免其受活性氧的損傷[48]。類似地,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在飼料中添加膽汁酸能夠提高草魚(Ctenopharyngodon idellus)血清的超氧化物歧化酶(SOD)的活性,機(jī)體的抗氧化能力得到顯著提高[49]。
?;撬幔捌溲苌铮┚哂星宄龣C(jī)體活性氧及其它氧化性有害物的功能。在本實(shí)驗(yàn)和有關(guān)學(xué)者對(duì)鯉的研究中[50]均得到了驗(yàn)證,本實(shí)驗(yàn)在飼料中添加牛磺酸后,鯉血清中的MDA含量明顯地降低、SOD活力和CAT活力隨著飼料中?;撬崽砑恿刻岣叨?,添加0.10%時(shí)效果最好,超過該添加量時(shí)抗氧化酶的活力反而下降,提示?;撬峥赡芫哂袟l件毒性,對(duì)于不同物種有一定的適宜添加范圍。
在高比例植物蛋白的低魚粉飼料中適量補(bǔ)充外源蛋氨酸,可以明顯改善飼料適口性,有效提高幼蟹對(duì)飼料的攝食和利用率,促進(jìn)幼蟹的生長(zhǎng);補(bǔ)充?;撬岷湍懼嵛茨苡行Ц纳朴仔返纳L(zhǎng),考慮到?;撬嶙鳛闂l件必需氨基酸所能發(fā)揮的促生長(zhǎng)效應(yīng)與膽汁酸的蛋白質(zhì)節(jié)約效應(yīng),都與飼料中的限制性氨基酸含量密切相關(guān),本研究提示,為了有效發(fā)揮牛磺酸和膽汁酸的飼料添加功效,應(yīng)注意在飼料中補(bǔ)充適宜比例和數(shù)量的限制性氨基酸,合理控制植物蛋白替代魚粉的比例,或通過補(bǔ)充限制性氨基酸,來(lái)提高機(jī)體的生長(zhǎng)和飼料利用效率。
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