大口黑鱸EST-SNP標(biāo)記開發(fā)及其與生長性狀的相關(guān)性分析

李勝杰，白俊杰，趙 犖，朱 冰，朱新平

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

大口黑鱸（Micropterus salmoides）俗名加州鱸，原產(chǎn)于北美洲，屬廣溫性魚種，在分類學(xué)上隸屬鱸形目太陽魚科。大口黑鱸具有肉質(zhì)鮮美、無肌間剌、適合高密度養(yǎng)殖和長途運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)，自上世紀(jì)70年代被引入我國大陸后進(jìn)行廣泛養(yǎng)殖，現(xiàn)已成為我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一，年產(chǎn)量超35萬噸［1］。隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，集約化程度不斷提高，大口黑鱸疾病頻發(fā)、生長不理想和養(yǎng)殖成本上升等制約了我國大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。因此，有必要通過人工選育提高養(yǎng)殖品種的生長性能，為大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供良種支撐。

分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)是通過與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行間接選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)，具有選擇強(qiáng)度大、不受環(huán)境影響和結(jié)果可靠等特點(diǎn)［2］。關(guān)聯(lián)分析是用分子標(biāo)記或者候選基因的遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀表型聯(lián)系起來的實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種的一種有效方法［3］。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是最常用的分子標(biāo)記，由于其全基因組覆蓋率和基因分型效率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于關(guān)聯(lián)分析和分子輔助育種［4-5］。目前大規(guī)模SNP標(biāo)記信息的獲得主要是通過基因組測(cè)序，但這種方法成本高，對(duì)于沒有基因組信息的非模式生物，可用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來開發(fā)大量 SNP標(biāo)記［6］。SALEM等［7］應(yīng)用 RNASeq技術(shù)對(duì)虹鱒（Oncorhynchusmykiss）生長快和生長慢群體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，將測(cè)序數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組參考序列比對(duì)后篩選出兩個(gè)群體的差異SNP，并與群體生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共鑒定出22個(gè)與生長性狀相關(guān)的 SNP。ULLOA等［8］采用RNA-seq技術(shù)分析了斑馬魚（Barchydanio rerio）生長快和生長慢群體的轉(zhuǎn)錄組，對(duì)獲得的164個(gè)候選SNP標(biāo)記與生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩選出5個(gè)生長相關(guān)標(biāo)記。本研究采用RNA-seq技術(shù)分析大口黑鱸生長快和生長慢個(gè)體肌肉組織轉(zhuǎn)錄組，通過SnaPshot分型技術(shù)驗(yàn)證候選SNP標(biāo)記，并進(jìn)一步分析標(biāo)記與生長性狀相關(guān)性，以期為大口黑鱸生長相關(guān)分子標(biāo)記開發(fā)和分子標(biāo)記輔助育種研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大口黑鱸“優(yōu)鱸1號(hào)”是經(jīng)連續(xù)多代選育而獲得的生長性能優(yōu)良的養(yǎng)殖新品種［9］。為測(cè)試其生長性能，對(duì)同為2月齡的大口黑鱸“優(yōu)鱸1號(hào)”和非選育大口黑鱸注射CWT標(biāo)記后在佛山市南海區(qū)九江鎮(zhèn)新旭養(yǎng)殖場(chǎng)的同一口池塘中進(jìn)行養(yǎng)殖，每天用冰鮮魚投喂，一天喂養(yǎng)兩次（8∶30和16∶30）。11月齡時(shí)，在大口黑鱸“優(yōu)鱸1號(hào)”群體中采集10 ind最大個(gè)體（快長組，平均體質(zhì)量為782.5±14.1g），在非選育大口黑鱸中采集10 ind最小個(gè)體（慢長組，平均體質(zhì)量為249.0±8.2 g），剪取每尾魚肌肉組織凍存于液氮中，用于總RNA提取。

用于關(guān)聯(lián)分析的大口黑鱸養(yǎng)殖群體來自新旭養(yǎng)殖場(chǎng)，該養(yǎng)殖群體是9 500 ind大口黑鱸“優(yōu)鱸1號(hào)”親本于2015年3月1日繁殖的后代。供試魚在相同條件下培育成魚種，然后在同一個(gè)池塘中進(jìn)行養(yǎng)殖，全程投喂冰凍野雜魚，11月齡時(shí)從群體中隨機(jī)取430 ind測(cè)量體質(zhì)量、全長、體高、頭長和尾柄長等性狀值，同時(shí)以抗凝劑（ACD）與血液體積比為6∶1的比例進(jìn)行尾靜脈活體取血，按天根生化科技（北京）有限公司的血液基因組DNA試劑盒中操作說明提取DNA，用瓊脂糖（Sigma公司，美國）凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)（Eppendorf公司，美國）測(cè)定DNA質(zhì)量和濃度，于-20℃保存。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自廣州艾基生物科技有限公司。

1.2 RNA提取、文庫構(gòu)建與測(cè)序

按照TaKaRa公司（大連）Trizol試劑盒說明書提取肌肉組織總RNA，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳（Bio-Rad公司，美國）和分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。構(gòu)建RNA文庫之前，每一個(gè)RNA樣品經(jīng)DNase I消化之后去除基因組DNA污染。每組中各個(gè)體的等量RNA混合一起組成測(cè)序樣品。采用OligotexmRNA Midi Kit試劑盒（Qiagen公司，美國）純化富集 Poly（A）mRNA，加入fragmentation緩沖液將mRNA打斷成200nt左右的短片段。以片段后的mRNA為模板，使用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈，然后加入緩沖液、dNTP、RNase和DNA聚合酶合成 cDNA第二條鏈。通過Qiaquick PCR提取試劑盒（Qiagen公司，美國）和EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)，對(duì)cDNA片段進(jìn)行純化。對(duì)純化后cDNA片段進(jìn)行加poly（A）尾及連接測(cè)序接頭，再經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，200 bp+25 bp的cDNA片段被純化并通過PCR擴(kuò)增目的片段，作為cDNA測(cè)序文庫。文庫構(gòu)建和測(cè)序均委托北京基因組中心完成，采用 Illumina HiSeqTM2000平臺(tái)（Illumina公司，美國）及single-end和paired-end技術(shù)獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中EST-SNP標(biāo)記的篩選與驗(yàn)證

為篩選SNP標(biāo)記，以2個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫產(chǎn)生的序列組裝而成的 unigene作為參考序列，用SOAPsnp軟件［10］比對(duì)單個(gè) read。SNP查找限于至少被5個(gè)clean reads覆蓋的unigene，最小等位基因質(zhì)量（每等位基因累計(jì)序列的質(zhì)量）不低于20。從關(guān)聯(lián)分析群體中選取30 ind極大和30 ind極小個(gè)體作為SNP標(biāo)記驗(yàn)證群體，選擇在大口黑鱸快長組和慢長組中均存在的75個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)于分型成功且可能與生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記進(jìn)一步在其余個(gè)體中進(jìn)行基因型分型，最后在大群體中做SNP標(biāo)記與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析。

委托上海捷瑞生物工程有限公司用SnaPshot方法［11］分型，具體方法如下：根據(jù)目標(biāo) SNPs側(cè)翼序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，然后對(duì)每個(gè)樣品的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增后取3μL PCR產(chǎn)物用Exo I和FastAP純化，主要是用Exo I去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物，用FastAP去除反應(yīng)中剩余的DNTP，37℃條件下15 min，80℃高溫滅活Exo I和FastAP酶15 min。根據(jù)ABI公司（美國）提供的SnaPshot試劑盒，用延伸引物進(jìn)行延伸反應(yīng)，使用ABI公司的PRISM 3730測(cè)序儀進(jìn)行基因分型。

表1 EST序列的基因注釋信息和SNP位置Tab.1 Gene annotation of EST sequences and positions of each SNP

1.4 大口黑鱸“優(yōu)鱸1號(hào)”群體的遺傳多樣性分析

采用 PopGene 32（Version 1.31）軟件（http：／／www.ualberta.ca／～fyeh／fyeh／）計(jì)算哈迪-溫伯 格 平 衡 （Hardy-Weinberg equiliberum，HWE）、有效等位基因數(shù)（N e）、觀測(cè)雜合度（H o）和期望雜合度（H e）。采用PIC-Calc0.6軟件，依據(jù)等位基因頻率計(jì)算各個(gè)SNP標(biāo)記的多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）。

1.5 SNP標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析

用SPSS 19.0軟件一般線性模型（general linearmodel）分析各個(gè)基因型與大口黑鱸生長性狀之間的相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)分析模型為Yij＝μ+Bi+eij。其中：Yij為某個(gè)性狀第i個(gè)標(biāo)記第j個(gè)個(gè)體上的觀測(cè)值；μ為實(shí)驗(yàn)觀測(cè)所有個(gè)體的平均值（即總體平均值）；Bi為第i個(gè)標(biāo)記的效應(yīng)值；eij為對(duì)應(yīng)于觀察值的隨機(jī)誤差效應(yīng)值［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及SNP檢測(cè)

大口黑鱸快長組和慢長組肌肉組織樣品RNA經(jīng)深度測(cè)序分別獲得5 406萬和5 474萬reads，經(jīng)組裝后分別獲得 84 602和 88 329 contigs，contig的平均長度分別為400 bp和418 bp。將獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)上傳到 NCBI數(shù)據(jù)上，登錄號(hào)為 SRA436296。Q20值大于98.51%，表明測(cè)序質(zhì)量較高。用RNA-seq技術(shù)在大口黑鱸快長組和慢長組中分別檢測(cè)到15 273和17 376個(gè)SNP標(biāo)記，其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)分別為9 720和11 085個(gè)，顛換位點(diǎn)分別為5 553和6 291個(gè)。A、C、G、T 4種類型堿基發(fā)生單核苷酸變異的數(shù)目介于1 057和5 573之間（表2）。6種單核苷酸變異中以C／T和A／G發(fā)生頻率最高，均大于30%，而其它4種單核苷酸變異 A／C、G／T、C／G、A／T發(fā)生頻率均在10%以下（表2）。

2.2 SNP標(biāo)記有效性檢測(cè)及在群體中的遺傳特征分析

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中EST-SNP標(biāo)記的有效性，挑選出75個(gè)SNP標(biāo)記在60個(gè)極端樣本中進(jìn)行SnaPshot分型，結(jié)果顯示：37個(gè)SNP標(biāo)記可成功分型，準(zhǔn)確率為49.3%。部分SNP標(biāo)記的堿基突變類型和遺傳參數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。各標(biāo)記的遺傳多態(tài)信息含量（PIC）介于0.287和0.375之間，根據(jù)PIC值介于0.25～0.50之間為中度多態(tài)，可知所有標(biāo)記都屬于中度多態(tài)位點(diǎn)。所有標(biāo)記的平均有效等位基因數(shù)（Ne）、平均觀測(cè)雜合度（Ho）和平均期望雜合度（He）分別為1.891、0.459和0.467，表明大口黑鱸“優(yōu)鱸 1號(hào)”群體的遺傳多樣性較豐富。Chi-square檢驗(yàn)分析表明，4個(gè)位點(diǎn)（CL1328.Contig1_All-3028、CL1115.Contig2_All-1357、Unigene14288_All-228、CL1339.Contig2_All-844）的基因型頻率分布偏離Hardy-Weinberg定律（P＜0.05），而其余位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg定律。

表2 大口黑鱸快長組和慢長組中的SNPs分布Tab.2 Distribution of SNPs in fast-grow ing and slow-grow ing group

表3 10個(gè)SNPs在大口黑鱸“優(yōu)鱸1號(hào)”群體中的遺傳多態(tài)性Tab.3 Genetic variability of 10 SNPs in Youlu No.1 largemouth bass population

2.3 SNP標(biāo)記與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

37個(gè)SNP標(biāo)記中有10個(gè)標(biāo)記在極端群體與大口黑鱸生長性狀中存在潛在相關(guān)性，進(jìn)一步在大群體中驗(yàn)證這些SNP標(biāo)記與生長性狀之間相關(guān)性（表4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10個(gè)SNP標(biāo)記在群體中均存在3種基因型，以所處堿基對(duì)表示基因型類型（表4），如 CL1452.Contig9_All-847標(biāo)記屬于C／T突變，存在CC和TT純合基因型，以及CT雜合基因型。CL1452.Contig9_All-847標(biāo)記CC基因型個(gè)體在體質(zhì)量、全長和尾柄長3個(gè)性狀的均值都顯著高于TT基因型個(gè)體（P＜0.05），CC型個(gè)體在體高、頭長上的均值都比TT型的均值高，但差異未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。其它位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的生長性狀均不存在顯著差異（P＞0.05）。

2.4 SNP標(biāo)記所處的unigene功能注釋

將CL1452.Contig9_All對(duì)應(yīng)的序列在NCBI在線數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與Rab-interacting lysosomal protein（RILP）相似度最高，且該基因序列中的 SNP標(biāo)記位于3′UTR，不編碼蛋白質(zhì)。其它unigene序列所注釋的基因名稱見表1。

3 討論

3.1 EST-SNP標(biāo)記開發(fā)

大口黑鱸是我國重要的經(jīng)濟(jì)淡水養(yǎng)殖品種之一，就目前研究來看，其分子標(biāo)記以微衛(wèi)星、AFLP和RAPD標(biāo)記為主，只有少數(shù)SNP標(biāo)記被報(bào)道［13］。SNP是基因組中冗余度低而覆蓋度最高的變異，具有便于高通量開發(fā)、快速分型等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜和發(fā)掘QTL和經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因［14］。目前利用基因組測(cè)序可以大規(guī)模開發(fā)SNP標(biāo)記，但是這種方式成本很高，而采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序既可快速獲得大量準(zhǔn)確序列信息，又可獲得大量SNP標(biāo)記，大大降低了成本［15］。本研究中利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到近2×104個(gè)大口黑鱸SNP標(biāo)記，EST序列中平均約2 kb出現(xiàn)1個(gè)SNP，明顯低于其它水產(chǎn)動(dòng)物EST中的 SNP標(biāo)記平均間距［如大黃魚（Larimichthys crocea）506 bp［16］、櫛 孔 扇 貝（Chlamys farreri）426.5 bp［17］、半 滑 舌 鰨（Cynoglossu semilaevis）491 bp［18］］。這種顯著差異可能與本研究采用了較為嚴(yán)格的篩選條件（SNP查找限于至少被5個(gè)clean reads覆蓋的unigene，最小等位基因質(zhì)量即每等位基因累計(jì)序列的質(zhì)量不低于20）有關(guān)，此外還受測(cè)序深度和精確度影響［15］。SNP統(tǒng)計(jì)顯示，6種變異類型中以C／T變異頻率最高（32%），這可能是由于CpG二核苷酸上甲基化的胞嘧啶殘基易自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶引起［19］。本研究選擇75個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)37個(gè)標(biāo)記具有多態(tài)性，SNP標(biāo)記的準(zhǔn)確性為49.3%，這與在大菱鲆［15］（Scophthalmus maximus，46.7%）、大西洋鱈［20］（Gadusmorhua，74.6%）和鯉［6］（Cyprinus carpio，48%）中標(biāo)記準(zhǔn)確性相近，這也反映了利用RNA-seq技術(shù)開發(fā)SNP標(biāo)記是一種有效的技術(shù)方法。

3.2 大口黑鱸“優(yōu)鱸1號(hào)”群體遺傳多樣性分析

雜合度反映了遺傳一致程度，而多態(tài)信息含量是衡量多態(tài)性的指標(biāo)。當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，該基因座為高度多態(tài)位點(diǎn)，0.25＜PIC＜0.5時(shí)，為中度多態(tài)位點(diǎn)，PIC＜0.25時(shí)為低度多態(tài)位點(diǎn)［21］。多態(tài)信息含量越大，說明該位點(diǎn)的雜合子比例越大，提供的遺傳信息越豐富［22-23］。在本研究中，10個(gè)SNP標(biāo)記都處于中度多態(tài)，能夠?yàn)樵u(píng)價(jià)大口黑鱸遺傳多樣性提供較充分的信息，這些標(biāo)記都沒有表現(xiàn)出高度多態(tài)性，原因在于SNP標(biāo)記是一種典型的兩等位基因標(biāo)記［21］。SNP標(biāo)記雖然不像微衛(wèi)星標(biāo)記具有較高的多態(tài)性，但它在基因組中的廣泛分布，彌補(bǔ)了其多態(tài)性較低的不足［24］。本實(shí)驗(yàn)所獲得的10個(gè)SNP標(biāo)記的平均多態(tài)信息含量為0.36，反映了大口黑鱸“優(yōu)鱸1號(hào)”群體具有較豐富的遺傳多樣性，可進(jìn)一步利用選育手段來提高其生長性能。李镕等［25］采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)分析得出大口黑鱸第4代選育群體（F4）的平均多態(tài)信息含量為0.39。本研究中所用的大口黑鱸“優(yōu)鱸1號(hào)”是第10代選育群體（F10），與F4相比，F(xiàn)10的平均多態(tài)信息含量減少了7.6%，這與大黃魚“官井洋優(yōu)快01”選育品系選育世代的遺傳多樣性指標(biāo)值隨著選育的進(jìn)行呈現(xiàn)下降的研究結(jié)果相一致［26］。通過人工選育手段對(duì)群體基因庫進(jìn)行高強(qiáng)度選擇會(huì)造成群體基因水平上的多樣性在一定程度上降低。F10的遺傳多樣性降低幅度很小，這與本實(shí)驗(yàn)選育過程中每代保持較多數(shù)量的繁育親本有關(guān)，可以盡可能避免近交引起負(fù)面影響。

表4 10個(gè)SNP標(biāo)記不同基因型與生長性狀的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between different genotypes for 10 SNP lociand grow th traits

3.3 SNP標(biāo)記與大口黑鱸生長性狀的相關(guān)性

經(jīng)BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)CL1452.Contig9_All-847標(biāo)記所處的基因序列與RILP-like protein 1相似度最高。RILP是Rab7的一個(gè)重要的效應(yīng)蛋白。RILP和 Rab7相互作用，并通過促進(jìn)Epidermal growth factor receptor（EGFR）降解負(fù)調(diào)控EGF激活的Akt信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖分化和凋亡［27］。目前關(guān)于RILP在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究鮮見報(bào)道。本研究首次在魚類RILP基因上篩選得到一個(gè)與生長性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，該標(biāo)記的CC基因型個(gè)體在體質(zhì)量、全長上顯著優(yōu)于TT基因型個(gè)體，我們推測(cè)RILP基因是與大口黑鱸生長相關(guān)的功能基因，對(duì)生長性狀發(fā)揮調(diào)控作用，但在其他品種中該基因?qū)ιL的調(diào)控作用還有待研究。CL1452.Contig9_All-847標(biāo)記處于3’非編碼區(qū)，不會(huì)引起其翻譯的氨基酸發(fā)生變化，但非編碼區(qū)中的堿基突變可影響mRNA的剪切從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能改變［29］，或與基因組區(qū)域中相鄰的重要突變位點(diǎn)連鎖。因此，本研究獲得的與大口黑鱸生長性狀相關(guān)的CL1452.Contig9_All-847標(biāo)記，可作為大口黑鱸分子標(biāo)記輔助育種研究中的候選標(biāo)記。

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