下調(diào)雄激素受體表達(dá)對(duì)不同類(lèi)型老年宮頸癌患者癌細(xì)胞活性的影響

楊 文 馮 文

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院 連云港市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 連云港 222000)

宮頸癌多發(fā)于絕經(jīng)后的老年女性，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)長(zhǎng)期感染是宮頸癌發(fā)生的必要因素〔1〕。相關(guān)研究顯示，高危型HPV誘發(fā)宮頸癌上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變中雄激素可能發(fā)揮協(xié)同、促進(jìn)作用〔2〕，而G蛋白耦聯(lián)受體(Cpr)30可參與介導(dǎo)雄激素的快速基因組轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與Cpr30/Tlr3信號(hào)通路有關(guān)〔3〕。雌激素在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中的作用已得到證實(shí)，但其中非激素依賴(lài)性的發(fā)生無(wú)法通過(guò)雌激素/雌激素受體通路加以解釋〔4〕。相關(guān)研究顯示，前列腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中，雄激素受體(AR)高表達(dá)與病情進(jìn)展有明顯關(guān)聯(lián)〔5〕。本研究選取C33a細(xì)胞為宮頸腺癌體外模型，Caski細(xì)胞為Ⅱ型宮頸鱗癌體外模型，以AR為靶點(diǎn)構(gòu)建小干擾RNA(siRNA)，慢病毒為載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，并探討其可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1材料與試劑 人宮頸腺癌細(xì)胞系C33a、宮頸鱗癌細(xì)胞系Caski均購(gòu)于上海素爾生物科技有限公司，主要試劑：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Trizol試劑盒購(gòu)于無(wú)錫市賽爾百靈生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于北京瑞爾欣德科技有限公司；AR抗體、帶熒光蛋白的慢病毒AR siRNA載體購(gòu)于杭州華安生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 C33a、Caski細(xì)胞分布置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃ 5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中孵育。用慢病毒AR siRNA載體轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞株進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取最佳培養(yǎng)條件和感染復(fù)數(shù)(MOI)值，轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下評(píng)定轉(zhuǎn)染效率，熒光率>80%者可進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，分為3組：AR干擾組(轉(zhuǎn)染AR基因慢病毒干擾載體)，陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染AR基因陰性慢病毒載體)，空白對(duì)照組(僅加入正常培養(yǎng)基)。轉(zhuǎn)染后均按原培養(yǎng)方案繼續(xù)培養(yǎng)，每組均分為兩份，分別用于RNA、蛋白提取。

1.3熒光定量PCR檢測(cè)AR mRNA表達(dá)情況 Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，使用SYBR GreenⅠMaster試劑進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，引物序列如下：AR上游：5′-TGGCRCRCRAACAACAAC-3′，下游：5′-GTAGGTGTGCGAGACGTC-3′；三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游：5′-CGTGGCAGTTCCGACTCT-3′，下游：5′-ACCACT TCGCGGT CAGCC-3′。反應(yīng)條件：95℃ 5 s，95℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。在每次延伸階段測(cè)吸光度值，雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4Western印跡檢測(cè)AR蛋白表達(dá)情況 蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，取上清測(cè)定蛋白濃度。取50 μg總蛋白，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉封閉后，加入兔抗人AR抗體(1∶500)，鼠源性β-actin單抗(1∶1 000)為內(nèi)參，4℃培養(yǎng)過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，培養(yǎng)4 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，避光環(huán)境下顯影、定影，分析各條帶灰度值。

1.5細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) Annexin染色法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，收集AR干擾組和陰性對(duì)照組細(xì)胞，磷酸緩沖液洗滌后，加緩沖液制成密度為1×105的細(xì)胞懸液；向流式細(xì)胞儀上樣管中加入100 μl細(xì)胞懸液，滴加染料混合均勻，室溫下暗室中靜置30 min，分別滴加500 μl緩沖液，60 min內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6Cpr30 mRNA和蛋白表達(dá)情況檢查 RT-PCR檢測(cè)Cpr30 mRNA表達(dá)情況：提取3組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系30 μl。擴(kuò)增條件同1.3，共40個(gè)循環(huán)；取擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。Western印跡檢測(cè)Cpr30蛋白表達(dá)情況：蛋白裂解液提取3組細(xì)胞總蛋白，行10% SDS-PAGE電泳，蛋白質(zhì)濕法轉(zhuǎn)移，免疫檢測(cè)，電化學(xué)顯影，軟件分析各條帶灰度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組AR mRNA及其蛋白表達(dá)情況 AR干擾組C33a、Caski AR mRNA及其蛋白的相對(duì)表達(dá)量較陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組C33a、Caski AR mRNA及其蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組宮頸癌細(xì)胞AR mRNA及其蛋白相對(duì)表達(dá)量

與AR干擾組比較：1)P<0.05

1為空白對(duì)照組；2 為AR干擾組；3為陰性對(duì)照組；下圖同圖1 各組宮頸癌細(xì)胞AR蛋白表達(dá)水平

2.2下調(diào)AR表達(dá)對(duì)各組宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響 AR干擾組C33a、Caski凋亡率較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組C33a、Caski凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AR干擾組內(nèi)比較顯示，C33a凋亡率明顯大于Caski凋亡率(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組宮頸癌細(xì)胞凋亡情況

與AR干擾組比較:1)P<0.05；與同組Caski細(xì)胞比較：2)P<0.05

2.3各組細(xì)胞中Cpr30 mRNA及其蛋白表達(dá)情況 AR干擾組Cpr30 mRNA及其蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)；而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組Cpr30 mRNA及其蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 各組細(xì)胞中Cpr30 mRNA及其蛋白相對(duì)表達(dá)量

與AR干擾組比較：1)P<0.05

圖2 各組C33a細(xì)胞、Caski細(xì)胞中Cpr30 mRNA表達(dá)情況

3 討 論

宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多因素調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，涉及抑癌基因、促癌基因、轉(zhuǎn)錄信號(hào)等多種信號(hào)通路途徑〔6〕。在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌等多種惡性腫瘤中AR基因的高表達(dá)與病情進(jìn)展和預(yù)后存在明顯關(guān)聯(lián)，AR基因已受到腫瘤基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，有望成為生殖道惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)。Cpr30與相應(yīng)配體相互結(jié)合后可有效活化表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號(hào)激酶，提升環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、鈣離子濃度，激活相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，使雌激素敏感器官出現(xiàn)增殖反應(yīng)〔7〕。Cpr30水平提升與卵巢癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有明顯關(guān)聯(lián)〔8〕。而AR表達(dá)改變對(duì)Cpr30水平的影響目前仍未見(jiàn)系統(tǒng)研究報(bào)道。本研究結(jié)果提示下調(diào)AR表達(dá)可提升Cpr30表達(dá)水平，進(jìn)而激活Cpr30/Tlr3信號(hào)通路，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。

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