老年腦梗死患者微栓子信號、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、載脂蛋白A1、脂蛋白磷脂酶A2水平

董禮全 孫海榮 王鵬飛 仲偉斌 高 犇 潘旭東

(威海市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 威海 264200)

腦梗死是一種不同分型的臨床綜合征，發(fā)病過程中伴有炎性免疫反應(yīng)。有報(bào)道在急性梗死動物的血液、腦組織病理中可見炎性免疫細(xì)胞異常反應(yīng)〔1，2〕。本研究分析老年腦梗死急性期患者動脈硬化斑塊、動脈狹窄及微栓子信號(MES)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、載脂蛋白(Apo)A1和脂蛋白磷脂酶(Lp-PL)A2的表達(dá)水平。

1 對象與方法

1.1對象 2012年10月至2015年1月青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院老年腦梗死患者222例，其中男121例，女101例，年齡61～95歲，平均(69±5)歲，符合第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議診斷表標(biāo)準(zhǔn)，病情允許且能配合檢查。對照組為我院同期查體者146例，其中男76例，女70例，年齡61～85歲，平均(65±4)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴腫瘤、免疫病、血液病、急性感染疾病者；②腦梗死后遺癥病史或近2 w服用抗血小板聚集、降脂藥者；③房顫及心臟超聲證實(shí)有心源性栓子來源患者；④腦出血患者；⑤近4 w有外傷史或外科手術(shù)史；⑥近2 w服用中藥湯劑者；⑦最近3個(gè)月參加過或者正在參加其他臨床研究者。

1.2動脈病變檢測 采用德利凱(EMS-9EBX2P)型超聲診斷儀，發(fā)病1 w內(nèi)完成檢測，探測顯示頸內(nèi)動脈起始至大腦中動脈M1段，觀察有無斑塊，測量管腔內(nèi)中膜厚度、管腔管徑。判斷標(biāo)準(zhǔn)：頸動脈內(nèi)中膜增厚>1.0 mm為增厚；管腔內(nèi)中膜局部增厚>1.2 mm粥樣硬化斑塊形成。斑塊分為以下4種：(1)較均的低回聲脂質(zhì)型軟斑塊；(2)等回聲的纖維型斑塊；(3)強(qiáng)回聲或伴聲影的鈣化型硬斑塊；(4)回聲不均的潰瘍型混合斑塊。軟斑塊及混合斑塊為不穩(wěn)定斑塊，纖維斑塊及鈣化型硬斑塊為穩(wěn)定斑塊。管腔狹窄程度：輕中度狹窄(<70%)；重度狹窄≥70%。

1.3MES的識別 采用德利凱(EMS-9EBX2P)型超聲診斷儀，發(fā)病1 w內(nèi)完成MES檢測，患者取安靜仰臥位，2 MHz探頭取得癥狀側(cè)大腦中動脈清晰信號，固定Spencer頭架，深度50～60 mm，兩點(diǎn)間距大于6 mm，取樣容積為6～12 mm，由2名神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師共同檢測，檢測完畢回放每個(gè)微栓子信號，除外偽差和干擾，采用1995年第9屆國際腦血液循環(huán)會議制定的標(biāo)準(zhǔn)，①時(shí)程短暫，持續(xù)時(shí)間<300 ms；②強(qiáng)度較背景血流信號≥3 dB;③單向出現(xiàn)于多普勒頻譜中；④音頻信現(xiàn)為“劈啪音”或“鳥鳴聲”；⑤在心動周期內(nèi)隨機(jī)出現(xiàn)；⑥在2個(gè)監(jiān)測深度存在時(shí)間延遲。檢測時(shí)間60 min，將監(jiān)測結(jié)果MES≥1者入選陽性組。

1.4Treg和ApoA1檢測 患者在入院次日清晨空腹肘靜脈采血2 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，6 h內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)檢測。EPICS XL-4型流式細(xì)胞儀進(jìn)口于美國貝克曼公司，Optilyse C溶血素，小鼠抗人熒光單抗CD25-FITC、CD4-PE-Cy5及同型對照進(jìn)口于法國Immunotech公司。小鼠抗人熒光單抗CD95-PE及同型對照購于晶美生物公司。抗體組合為CD25-FITC、CD95-PE、CD4-PE-Cy5。CD4+CD25+Treg中CD25表達(dá)熒光強(qiáng)度>100者為CD4+CD25highTreg。以FS-SS設(shè)門分析外周血Treg和CD95/ApoA1的表達(dá)。見圖1。

1.5Lp-PLA2檢測 患者在入院次日清晨空腹肘靜脈采血2 ml，EDTA抗凝，1 500 r/min離心10 min，收集上清液，-70℃保存，應(yīng)用中美合資天津康爾克生物科技有限公司試劑盒，固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，175 ng/ml以下為正常。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)。

圖1 流式細(xì)胞檢測圖

2 結(jié) 果

腦梗死組MES陽性率、ApoA1、Lp-PLA2水平顯著高于對照組，Treg水平顯著低于對照組(P<0.05)。不穩(wěn)定斑塊組MES陽性率顯著高于非不穩(wěn)定斑塊組和對照組，Treg顯著低于非不穩(wěn)定斑塊組和對照組，ApoA1顯著高于非不穩(wěn)定斑塊組和對照組，Lp-PLA2顯著高于非不穩(wěn)定斑塊組和對照組(均P<0.05)。重度狹窄組MES陽性率顯著高于非重度狹窄組和對照組，Treg顯著低于對照組，ApoA1顯著高于對照組，Lp-PLA2顯著高于非重度狹窄組和對照組(均P<0.05)。MES陽性組Treg顯著低于MES陰性組和對照組，ApoA1顯著高于MES陰性組和對照組，Lp-PLA2顯著高于MES陰性組和對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組 MES、Treg、ApoA1、Lp-PLA2的檢測

與對照組比較：1)P<0.05；與非不穩(wěn)定斑塊組比較：2)P<0.05;與非重度狹窄組比較：3)P<0.05；與MES陰性組比較：4)P<0.05

3 討 論

腦梗死是由多種病因所引起的腦細(xì)胞缺血壞死，老年腦梗死病因包括年齡、高血壓、糖尿病、吸煙、高脂血癥、家族遺傳等有關(guān)，部分患者病因不明，其中動脈粥樣硬化仍然是老年腦梗死的主要病理改變，可表現(xiàn)為動脈內(nèi)膜增厚、斑塊形成、動脈狹窄等〔3，4〕，患者動脈硬化斑塊好發(fā)于頸內(nèi)動脈虹吸段、頸動脈分叉處等，斑塊的大小關(guān)乎動脈腔的通暢，斑塊纖維膜是否破潰關(guān)乎是否形成附壁血栓，斑塊是否穩(wěn)定關(guān)乎是否出現(xiàn)斑塊脫落而引起的栓塞，進(jìn)而可出現(xiàn)腦梗死。MES是腦梗死危險(xiǎn)因素〔5〕，歐洲腦卒中組織(ESO)指出經(jīng)顱多普勒(TCD)是監(jiān)測腦血流中MES的唯一方法〔6〕。Treg在維持人體正常免疫耐受中發(fā)揮重要的作用〔7，8〕，其在腦梗死急性期間的具體作用機(jī)制尚不明確，近來研究表明，只有高表達(dá)CD25的Treg在免疫抑制功能方面更具代表性。ApoA1為凋亡因子〔9〕，其屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族。腦梗死急性期大量腦細(xì)胞死亡，繼而大量膠質(zhì)細(xì)胞增殖，凋亡伴隨在腦梗死全過程〔10〕，Lp-PLA2是一種新的炎癥標(biāo)記物，具有促炎癥的作用，Lp-PLA2在破裂動脈粥樣斑塊中凋亡的巨噬細(xì)胞高聚集區(qū)中高度表達(dá)〔11，12〕。

動脈粥樣硬化不可避免地伴隨在人類的生命之中，頸部動脈粥樣硬化是全身動脈粥樣硬化的縮影，可在局部表現(xiàn)為形成斑塊，斑塊也可隨年齡增加而增大，可能因?yàn)橹委煻€(wěn)定或逆轉(zhuǎn)。斑塊的性狀受多種因素影響，一般年齡、男性、吸煙、高血壓、糖尿病及高脂血癥等是斑塊形成的常見因素〔13〕。有些斑塊可短期內(nèi)增大明顯，斑塊內(nèi)粥樣物質(zhì)短期內(nèi)增多，纖維帽相對變薄，一旦破潰，則斑塊表面容易形成血小板、紅細(xì)胞等聚集，在局部形成新的血栓或者脫落后形成栓子。本研究發(fā)現(xiàn)在急性期不穩(wěn)定斑塊患者外周血ApoA1 升高，Treg降低，提示免疫耐受受到抑制，細(xì)胞凋亡增速，可能與斑塊內(nèi)皮細(xì)胞、泡沫細(xì)胞和梗死的腦細(xì)胞有關(guān)。Tsimikas等〔14〕認(rèn)為Lp-PLA2是識別腦卒中風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)警因子，與本文結(jié)果一致。

腦血供分為全循環(huán)和后循環(huán)，一般約有4/5的腦血供來自前循環(huán)，頸內(nèi)動脈狹窄則引起血供減少，為了滿足腦血供被迫經(jīng)基底動脈環(huán)等代償，可引起前循環(huán)盜血、代償性血壓增高，心臟負(fù)擔(dān)代償增加，灌注不足引起前后循環(huán)缺血，后循環(huán)過度灌注誘發(fā)后循環(huán)腦出血等風(fēng)險(xiǎn)〔15〕，動脈粥樣硬化斑塊體積的擴(kuò)增是導(dǎo)致頸動脈管腔狹窄最常見的病因。如果不穩(wěn)定斑塊破潰，表面聚集形成血栓，也可短時(shí)間引起管腔狹窄或閉塞。頸動脈狹窄常位于頸內(nèi)外動脈分叉段、虹吸部及頸內(nèi)動脈末段〔16〕。這些部位發(fā)生血流動力學(xué)改變，血流對動脈內(nèi)膜沖擊大，容易形成內(nèi)皮損傷和湍流，長期頸動脈狹窄可引起智能下降〔17〕。本研究提示狹窄部位有利于MES形成。腦梗死預(yù)警因子Lp-PLA2水平高，可能與狹窄部位血管內(nèi)皮損傷有關(guān)，大部分頸動脈狹窄慢性進(jìn)展形成，即便是在發(fā)生急性腦梗死時(shí)，炎癥免疫反應(yīng)也相對較輕。

TCD可以檢測到的血流中通過的微小顆粒信號稱為MES，這些小顆粒多為微小血栓碎片等〔18〕。腦血流中MES的發(fā)現(xiàn)加深了對腦梗死發(fā)病機(jī)制的理解，特別是腦栓塞機(jī)制有了直觀的證據(jù)，MES對缺血性腦卒中有預(yù)警有作用，MES減少是有療效的依據(jù)〔19〕。本研究說明MES陽性患者體內(nèi)明顯的存在炎性免疫反應(yīng)，Treg 降低提示患者免疫耐受不穩(wěn)，出現(xiàn)了急性免疫反應(yīng)，ApoA1升高可能與微小栓子栓塞引起腦細(xì)胞壞死有關(guān)，盡管這種栓塞在目前的彌散加權(quán)成像(DWI)也不能完全可視，但確實(shí)存在。Lp-PLA2水平高提示血管內(nèi)皮炎癥較重，也是MES大部分來源于受損的動脈內(nèi)膜的側(cè)面證據(jù)?；颊叨鄟碓从谥鲃用}弓以上的前循環(huán)系統(tǒng)，如果在頸動脈未發(fā)現(xiàn)栓子來源則提示臨床應(yīng)該向下尋找如心臟和主動脈弓甚至下肢動脈病變。

綜上，腦梗死是一類血栓病變，是一類血管壁病變，也是一類炎癥免疫病變。腦梗死急性期對上述指標(biāo)檢測有利于合理判斷病情，對充分理解發(fā)病機(jī)制有幫助，對抗血小板聚集、調(diào)制穩(wěn)定板塊抗炎等治療的強(qiáng)度和療程有指導(dǎo)意義，對個(gè)體化診治有促進(jìn)作用。

1Lee JH，Kwon KY，Yoon SY，etal. Characteristics of platelet indices，neutrophil-to-lymphocyte ratio and erythrocyte sedimentation rate compared with C reactive protein in patients with cerebral infarction：a retrospective analysis of comparing haematological parameters and C reactive protein〔J〕.BMJ Open，2014；4(11):e006275.

2Garcia JH，Liu KF，Ho KL. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex〔J〕. Stroke，1995;26(4):636-43.

3Kobayashi A，Wardlaw JM.Oxfordshire community stroke project clinical stroke syndrome and appearances of tissue and vascular lesions on pretreatment CT in hyperacute ischemic stroke among the first 510 patients in the third international stroke trial (IST-3)〔J〕. Stroke，2009；40(3)：743-8.

4Kinsella JA，Tobin WO，Kavanagh GF，etal. Increased thrombin generation potential in symptomatic versus asymptomatic moderate or severe carotid stenosis and relationship with cerebral microemboli〔J〕. J Neurol Neurosurg Psychiatry，2015；86(4)：460-7.

5Müller HF，Viaccoz A，F(xiàn)isch L，etal.18FDG-PET-CT：an imaging biomarker of high-risk carotid plaques. Correlation to symptoms and microembolic signals〔J〕. Stroke,2014；45(12)：3561-6.

6Jeong HS，Song HJ，Lee JH，etal. Interpretation of TCD spectral patterns detected during carotid artery stent interventions〔J〕. J Endovasc Therapy，2011；18(4)：518-26.

7Wang WJ，Liu FJ，Liu X，etal. Adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+CD25+regulatory T cells reverses the increase in abortion rate caused by interleukin 17 in the CBA/JxBALB/c mouse mode〔J〕. Hum Reprod，2014；29(5)：946-52.

8Dennis B，Gower L，Emanuela I，etal. Mast cells suppress murine GVHD in a mechanism independent of CD4+CD25+regulatory T cells〔J〕. Blood，2013；122(22)：3659-65.

9Fortner KA，Rosemary K. Fas (CD95/APO-1) limits the expansion of T lymphocytes in an environment of limited T-cell antigen receptor/MHC contacts〔J〕. Int Immunol，2011；23(2)：75-88.

10Fortner KA,Budd RC. The death receptor Fas (CD95/APO-1) mediates the deletion of T lymphocytes undergoing homeostatic proliferation〔J〕. J Immunol，2005；175(7)：4374-82.

11Matter CM，Chadjichristos CE,Meier P,etal. Role of endogenous Fas (CD95/Apo-1) ligand in balloon-induced apoptosis，inflammation，and neointima formation〔J〕. Circulation，2006；113(15)：1879-87.

12Wang T，Karino K，Yamasaki M,etal. Effects of G994T in the Lp-PLA2 gene on the plasma oxidized LDL level and carotid intima-media thickness in Japanese：the Shimane Study〔J〕.Am J Hypertens，2009；22(7)：742-7.

13邵 紅，謝立凱，呂 丹.2型糖尿病患者血糖波動與頸動脈粥樣硬化斑塊的相關(guān)性〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；31(12)：4518-20.

14Tsimikas S，Mallat Z，Talmud PJ，etal. Elevated oxidized phospholipids on apolipoprotein B-100 particles predict 6-year cardiovascular events in the Epic-Norfolk Study：potentiation of risk with lipoprotein-associated (Lp-PLA2) and soluble phospholipase A2 (sPLA2) activity〔J〕. Circulation，2008；10:118-23.

15Sharma VK，Paliwal PR，Sinha AK. Plaque inflammation imaging in severe carotid stenosis and recurrent cerebral ischemia〔J〕.J Nucl Med Technol，2015;43(4):299-300.

16董禮全.MES與CD4+CD25+Treg等指標(biāo)的研究〔D〕.青島：青島大學(xué)，2016.

17向 靜.老年認(rèn)知功能障礙與頸動脈硬化及相關(guān)基因多態(tài)性研究〔D〕.重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2013.

18Wang HJ，Kim SJ，Hong JM，etal. Microembolic signals in acute posterior circulation cerebral ischemia：sources and consequences〔J〕. Stroke，2012；43(4)：747-52.

19Al-Atassi T,Lam K,Forgie M,etal. Cerebral microembolization after bioprosthetic aortic valve replacement：comparison of Warfarin plus aspirin versus aspirin only〔J〕. Circulation，2012；126(11 suppl 1)：S239-44.