胰酶激活的E型肉毒毒素及其類毒素免疫原性研究

段麗娟，李育合，謝小榮，孟祥玉，戴于棟，金學敏，高建軍

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胰酶激活的E型肉毒毒素及其類毒素免疫原性研究

段麗娟，李育合，謝小榮，孟祥玉，戴于棟，金學敏，高建軍

730046 蘭州生物制品研究所有限責任公司血清室

胰酶激活 E 型肉毒毒素，并研究其類毒素免疫原性。

胰酶激活 E 型肉毒毒素，脫毒后制備類毒素，免疫家兔，與常規(guī)方法制備的 E 型肉毒類毒素比較免疫原性。

胰酶激活 E 型肉毒毒素的最佳條件為胰酶濃度0.5%、激活時間 45 min、pH 6.0、溫度37 ℃，在此條件下可提高毒素毒力 1000 倍，但其類毒素免疫原性與常規(guī)方法無顯著性差異。

胰酶激活 E 型肉毒毒素，可大幅度提高毒素毒力，但并未改變其免疫原性。

胰酶； 類毒素類； 免疫原性； E 型肉毒毒素

肉毒毒素（botulinum toxin）是由厭氧的肉毒梭菌（clostridium botulinum）在生長繁殖過程中產(chǎn)生的一種細菌外毒素，它能引起以運動神經(jīng)麻痹癥狀為主的死亡率極高的中毒性疾病。肉毒梭菌及其毒素根據(jù)毒素抗原性的不同，可分為 A、B、C、D、E、F、G 七個型。其中 A、B、E 是人類罹患肉毒中毒的主要型別，F(xiàn) 型僅有少數(shù)幾起人中毒的報道，而 G 型至今尚無致人中毒的確鑿證據(jù)。C、D 型除個別病例外，主要是牲畜和禽類中毒的病原[1]。在我國，E 型肉毒中毒在青海省等青藏高原地區(qū)多有發(fā)生，中毒癥狀一般為視覺模糊、呼吸困難、眼瞼下垂、吞咽困難及全身乏力等[2-3]。對于肉毒毒素中毒的治療，通常用抗毒素來中和。由于抗毒素與毒素的結(jié)合具有嚴格的特異性，因此 E 型肉毒中毒只能用特異性的 E 型肉毒抗毒素來進行治療。由于高品質(zhì)的抗毒素依賴于免疫原性較高的抗原免疫動物后獲得的高效價的免疫血漿，因此，制備高免疫原性的免疫原是提高抗毒素質(zhì)量的前提條件之一。

E 型肉毒梭菌及其毒素具有與其他型別不同的生物特性與多樣性[4-5]，在其生產(chǎn)過程中會出現(xiàn)毒力值較低的情況，導致免疫動物后血漿免疫效價不理想。為制備具有高免疫原性的 E 型肉毒免疫原，需探索不同方法優(yōu)化其毒素、類毒素的制備過程。本實驗通過加入一定量的胰酶，對毒素蛋白進行激活的方法制備 E 型肉毒毒素，脫毒后免疫動物，研究其免疫原性。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基 實驗用 E 型肉毒梭菌菌種（批號：WS-E20110901）、多價肉毒毒素診斷血清和 E 型肉毒梭菌培養(yǎng)基分別由本公司毒素制劑室和培養(yǎng)基室提供。

1.1.2 試劑與儀器 硫酸、甲醛購自國藥集團化學試劑有限公司；澄清及除菌過濾濾芯購自美國 PALL 公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學儀器有限公司。

1.1.3 實驗動物 昆明小鼠（雄性，14 ~ 16 g，批號 20150323）、豚鼠（雄性，350 g，批號 20150305）、青紫藍兔（雌性，2500 g，批號 2150226）均由本公司實驗動物室提供，飼養(yǎng)環(huán)境為 18 ~ 29 ℃，相對濕度 40%~ 70%。

1.2 方法

1.2.1 E 型肉毒毒素的制備 將 E 型肉毒梭菌菌種復蘇后，吸取菌液接種于 CM 培養(yǎng)基大管中，30 ℃厭氧培養(yǎng) 48 h。之后將大管的培養(yǎng)液接種于 CM 培養(yǎng)基扁瓶中，輕微振蕩混勻后 30 ℃厭氧培養(yǎng) 24 h。最后將扁瓶培養(yǎng)物接種于含 CM 培養(yǎng)基的大立瓶中進行產(chǎn)毒培養(yǎng)，輕微振蕩混勻后 30 ℃培養(yǎng) 5 d。

1.2.2 E 型肉毒毒素的胰酶激活及檢定 胰酶激活 E 型肉毒毒素的主要影響因素為胰酶濃度、激活時間、pH、溫度等條件。在本實驗中將以上條件的篩選范圍選定為：胰酶濃度 0%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%；激活時間為 30、45、60、90 min；pH 調(diào)為 5.0、6.0、7.0；溫度為 30、35、37、40 ℃。在以上條件中用 Design Expert 軟件做實驗設計，通過測定胰酶激活后毒素毒力，篩選最佳實驗條件。

將培養(yǎng)的 E 型肉毒毒素平均分為 2 份，一份批號為 201502002-1，另一份用篩選好的條件進行胰酶激活，批號為 201502002-2。

1.2.3 E 型肉毒類毒素的制備及檢定 采用甲醛分段脫毒法，分別將上述兩種方法制備的 E 型肉毒毒素脫毒，制備類毒素。即按原毒素的量首次緩慢加入福爾馬林 0.2%，邊加邊搖勻，封口后置于 37 ℃脫毒7 d。再次加入 0.1% 福爾馬林，37 ℃放置 7 d。根據(jù)國家藥典要求進行結(jié)合力、蛋白氮（PN）、總氮（TN）、pH 測定、脫毒檢查及毒性逆轉(zhuǎn)試驗[6]。

1.2.4 抗原配制及家兔免疫 根據(jù)類毒素結(jié)合力的檢定結(jié)果，配制免疫用抗原（蛋白含量為2.0 mg/ml）。按常規(guī)免疫程序，分別進行基礎免疫和三程超免疫。胰酶激活組與非激活組各程次均注射相同免疫劑量，各程次免疫劑量見表 1。每程次在第 2 針注射后第 20 天采集左右耳緣靜脈血檢測免疫效價。

2 結(jié)果

2.1 肉毒毒素型特異性檢查

用多價肉毒毒素診斷血清，按參考文獻[7]所述方法分別對上述試驗獲得的毒素進行型特異性檢查。檢定結(jié)果（表 2）顯示，兩個批號的毒素均為 E 型肉毒毒素。

2.2 E 型肉毒毒素的胰酶激活條件篩選

用 Design Expert 軟件對胰酶激活條件進行篩選比對，結(jié)果顯示 E 型肉毒毒素的胰酶激活條件為胰酶濃度 0.5%、pH 6.0、溫度 37 ℃、激活時間 45 min 時效果最佳（篩選過程實驗數(shù)據(jù)略）。試驗結(jié)果見表 3。

2.3 E 型肉毒毒素毒力測定

按參考文獻[7]所述方法分別對 E 型肉毒毒素激活組和未激活組進行毒力測定，結(jié)果見表 4。

2.4 E 型肉毒類毒素的制備及檢定

將兩個批號毒素分別加適量甲醛，37 ℃脫毒，制成類毒素。兩組類毒素脫毒檢查和毒性逆轉(zhuǎn)試驗均合格。結(jié)合力、蛋白氮（PN）、總氮（TN）及 pH 測定結(jié)果見表 4。

2.5 抗原配制

根據(jù)E 型肉毒類毒素的結(jié)合力進行抗原配制，配制抗原結(jié)合力見表 4。

表 1 家兔免疫程序

表 2 肉毒毒素型特異性檢查

表 3 Design Expert 試驗結(jié)果

表 4 E 型肉毒毒素未激活組和激活組檢測結(jié)果

2.6 家兔免疫效價結(jié)果

按《中國藥典》規(guī)定方法對每程采血血樣進行效價測定，每個樣品檢測 3次，用 SPSS 軟件對兩個批號的 3 個程次的平均免疫效價結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示值為 0.688（表 4），說明胰酶激活組和未激活組的 E 型肉毒毒素制備的抗原免疫家兔后，免疫效價無顯著性差異。

3 討論

制備高免疫原性的免疫原來免疫動物，從而獲得高效價的抗毒素免疫血漿，這對提高抗毒素產(chǎn)品的抗體效價與比活性是尤為重要的。因此為了獲得高效價、高比活性的 E 型肉毒抗毒素，需要生產(chǎn)制備出高免疫原性的 E 型肉毒類毒素。

在本實驗中我們從胰酶濃度（0% ~ 1.0%）、激活時間（30 ~ 90 min）、pH值（5.0 ~ 7.0）、溫度（30 ~ 40 ℃）這 4 個試驗因素入手，最后選定最佳試驗條件為：胰酶濃度 0.5%、激活時間45 min、pH 6.0、溫度 37 ℃。通過試驗對比得出，以上條件下胰酶激活制備的 E 型肉毒毒素，毒力顯著上升，增加了 103LD50/ml。

將胰酶激活的 E 型肉毒毒素與常規(guī)方法制備的 E 型肉毒毒素脫毒后免疫動物，結(jié)果顯示免疫效價并未發(fā)生顯著變化，說明胰酶激活 E 型肉毒毒素雖可以使毒素毒力大幅度提高，然而并不改變其免疫原性。E 型肉毒梭菌及其毒素具有與其他型別不同的生物特性與多樣性，胰酶使其單鏈蛋白質(zhì)上的賴氨酰鍵被切開，產(chǎn)生兩條多肽鏈，為激活的衍生毒素，這種游離的毒性成分使得毒素毒力增強。但類毒素免疫原性的提高還需要在精制提純抗原方面入手，通過硫酸銨鹽析、酸沉淀法、柱層析法等方法來進行探索。本實驗為 E 型肉毒毒素的相關(guān)研究提供了數(shù)據(jù)支持，建立了技術(shù)平臺。

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Immunogenicity research of the toxoid prepared from tyrisin activated botulinum toxin type E

DUAN Li-juan, LI Yu-he, XIE Xiao-rong, MENG Xiang-yu, DAI Yu-dong, JIN Xue-min, GAO Jian-jun

Author Affiliation: Lanzhou Institute of Biological Products Co.Ltd., Lanzhou 730046, China

To study and evaluation immunogenicity of the toxoid prepared from tyrisin activated botulinum toxin type E.

Tyrisin were used to activate the toxin of botulinum toxin type E. After detoxified, the rabbits were immuned with the toxoid and immunogenicity were compared with the toxoid prepared from conventional method.

The optimal conditions of trypsin activation were set as follows: 0.5% trypsin concentration, 45 min activation time, pH 6.0, at 37℃. Under these conditions, the toxicity of the tyrisin activated botulinum toxin type E could be increased by 1000times, while the immunogenicity of the toxoid had no significant difference as compared with conventional method.

The toxicity of botulinum toxin type E could be greatly improved through the process of tyrisin activation, but its immunogenicity remains unchanged.

Pancreatin; Toxoids; Immunogenicity; Botulinum toxin type E

GAO Jian-jun, Email: gao5369@163.com

高建軍，Email：gao5369@163.com

2017-09-18

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.008