初診時EB病毒陽性淋巴瘤46例臨床分析

魏天南　尚晉　林蕓　王志紅　陳為民

[摘要] 目的 觀察淋巴瘤患者Epstein-Barr（EB）病毒DNA水平（EBV DNA）的變化并探討其與臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。方法 收集2013年1月～2016年12月福建省立醫(yī)院血液科收治的初診時EB病毒陽性的淋巴瘤病例共46例并進(jìn)行回顧性分析，觀察EBV DNA拷貝數(shù)的變化，并通過觀察臨床表現(xiàn)、乳酸脫氫酶（LDH）水平和β2微球蛋白（β2-MG）水平，匯總分析EBV DNA水平與淋巴瘤患者臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。 結(jié)果 納入的46例患者分別檢測初診時、4個療程結(jié)束后的EBV DNA、LDH、β2-MG水平，結(jié)果提示EBV DNA水平與患者LDH、β2-MG表達(dá)水平有關(guān)（P均<0.05）。療效評判結(jié)果顯示，與初診時EBV DNA水平相比，4個療程治療結(jié)束后 EBV DNA升高和下降的兩組之間，在臨床療效上存在顯著性差異（P<0.05）。 結(jié)論 EBV DNA的變化與淋巴瘤臨床轉(zhuǎn)歸有關(guān)，可作為EBV陽性淋巴瘤患者治療效果和預(yù)后評估的參考指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] EB病毒;淋巴瘤;預(yù)后;療效

[中圖分類號] R733.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2018）33-0087-04

EB病毒（EBV）是人類皰疹病毒科γ亞科的DNA病毒，又稱人類皰疹病毒4型，具有嗜B淋巴細(xì)胞的特性，主要潛伏感染B淋巴細(xì)胞并刺激細(xì)胞增生和轉(zhuǎn)化[1]。資料顯示，90%～95%的正常成年人有血清感染EBV的證據(jù)，但只有其中少部分存在臨床進(jìn)展[2]。多項(xiàng)研究顯示，EBV感染與淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有密切聯(lián)系[3-4]。乳酸脫氫酶（LDH）與β2微球蛋白（β2-MG）均被認(rèn)為是判斷淋巴瘤疾病的侵犯程度、分期和判斷療效及預(yù)后的重要指標(biāo)，尤其在淋巴瘤的國際預(yù)后指數(shù)評分（IPI評分）中，LDH水平被認(rèn)為是最重要的獨(dú)立預(yù)后因素[5]。為了動態(tài)觀察EBV DNA水平與淋巴瘤疾病進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，本研究回顧性分析了我院收治的初診時EBV陽性淋巴瘤患者在治療過程中的EBV DNA水平及LDH、β2-MG的水平并觀察其與臨床療效的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

回顧性分析2013年1月～2016年12月福建省立醫(yī)院血液科收治的初診時EB病毒陽性的淋巴瘤病例共46例（以初診時EBV DNA>103 copies/mL為陽性），其中彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤25例，NK/T細(xì)胞淋巴瘤13例，血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤8例。患者年齡最大78歲，最小23歲，中位年齡58歲;男24例，女22例。Ann Arbor分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期19例，Ⅲ期10例，Ⅳ期11例。所有患者均經(jīng)淋巴結(jié)活檢、病理證實(shí)診斷，并按照美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南推薦方案進(jìn)行規(guī)范化療[6]，平均至少化療4個療程。

1.2 檢測方法

采用PCR體外擴(kuò)增法檢測EBV DNA水平。選用廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的EB病毒核酸擴(kuò)增PCR熒光定量檢測試劑盒。抽取患者靜脈血2 mL，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，輕輕顛倒混勻，密閉送檢。取全血1 mL加入干燥玻璃試管中，加入生理鹽水1 mL輕搖混勻，取干燥玻璃試管加入500 μL淋巴細(xì)胞分離液。將稀釋好的全血用移液器緩慢加入加有淋巴細(xì)胞分離液的試管中，2000 rpm離心20 min，吸取白細(xì)胞層加入1.5 mL離心管，12 000 rpm離心5 min，去上清，沉淀中加入50 μL DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理10 min;12 000 rpm再次離心5 min后，備檢。取PCR反應(yīng)管，加入處理后的樣品上清液2 μL，8000 rpm離心數(shù)秒后，打開程序instrument窗口，設(shè)置循環(huán)條件：93℃ 2 min，93℃ 45 s→55℃ 60 s，10個循環(huán)，93℃ 30 s→55℃ 45 s，30個循環(huán)，保存文件，運(yùn)行，得出結(jié)果，計算樣品中EBV DNA含量，以DNA拷貝數(shù)≤1×103 copies/mL為陰性結(jié)果，>1×103/mL為陽性結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)

初診時統(tǒng)計所有患者的年齡、性別、體能評分（ECOG）和國際預(yù)后指數(shù)（IPI）等指標(biāo)，并檢測所有患者初診時、治療4個療程后的EBV DNA、LDH、β2-MG水平。根據(jù)EBV DNA水平的轉(zhuǎn)歸，將患者分為兩組，分別為EBV DNA升高組（18例）和EBV DNA下降組（28例）。

1.4 療效評價

46例淋巴瘤患者均按照NCCN指南推薦方案進(jìn)行規(guī)范化療，平均至少化療4個療程。并在初診時與4個療程后各行PET-CT檢查1次，并根據(jù)NCCN指南進(jìn)行療效評估，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）和疾病復(fù)發(fā)或進(jìn)展（PD），如下所述。最遲隨訪日期定為2017年12月31日。

1.4.1 完全緩解? 所有的病灶證據(jù)均消失。治療前FDG高親和性或PET陽性的患者，PET完全轉(zhuǎn)陰;治療前FDG親和性不確定的患者：CT顯示病灶縮小至正常大小。肝脾不能觸及，所有結(jié)節(jié)消失。骨髓活檢結(jié)果陰性，或免疫組化結(jié)果陰性。

1.4.2 部分緩解? 可測量病灶縮小，沒有新病灶。6個最大病灶SPD（最大垂直徑乘積之和）縮小≥50%，其他結(jié)節(jié)大小未增加。肝脾結(jié)節(jié)SPD或單個結(jié)節(jié)最大橫徑縮小≥50%，肝脾沒有增大。

1.4.3 疾病穩(wěn)定? 未達(dá)CR/PR或PD。

1.4.4疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)? 任何新增加的病灶或原病灶直徑增大≥50%。出現(xiàn)任何徑線>1.5 cm的新病灶或多個病灶SPD增加。肝脾任何病灶SPD增大>50%。骨髓出現(xiàn)新發(fā)或復(fù)發(fā)病灶。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。EBV DNA含量與臨床指標(biāo)、LDH、β2-MG水平的關(guān)系分析采用χ2檢驗(yàn)，EBV DNA水平與疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系等等級資料比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBV DNA水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系

46例淋巴瘤患者均按照NCCN指南推薦方案進(jìn)行規(guī)范化療，平均至少化療4個療程。初診時評估相關(guān)臨床特征包括ECOG評分與IPI評分。初診時、治療4個療程后分別檢測EBV DNA、LDH與β2-MG水平。結(jié)果顯示，在EBV DNA升高與下降的兩組之間比較，EBV DNA的轉(zhuǎn)歸水平與IPI評分、ECOG評分、LDH及β2-MG水平有關(guān)（P<0.05）。見表1。

2.2 EBV DNA水平與疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系

46例淋巴瘤患者均按照NCCN指南推薦方案進(jìn)行規(guī)范化療，平均至少化療4個療程。初診時和4個療程化療結(jié)束后，分別行PET-CT檢查各1次，并根據(jù)NCCN指南進(jìn)行療效評估。將評估結(jié)果用于比較病程轉(zhuǎn)歸與EBV DNA水平之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，與初診時EBV DNA水平相比，治療過程中EBV DNA升高18例，其中CR 1例，PR 4例，SD 4例，PD 9例;與初診時EBV DNA水平相比，治療過程中EBV DNA下降28例，其中CR 19例，PR 4例，SD 3例，PD 2例。在EBV DNA下降的28例中，有20例EBV DNA轉(zhuǎn)陰，其中CR 18例，PR 2例。結(jié)果提示EBV DNA升高和下降的兩組比較，臨床療效存在顯著性差異（P<0.05）。見表2。

3 討論

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一種嗜人類淋巴細(xì)胞的雙鏈DNA線狀γ皰疹病毒。EBV有嗜淋巴細(xì)胞尤其是B淋巴細(xì)胞的特性，其DNA在受感染細(xì)胞核染色體外可結(jié)成環(huán)狀結(jié)構(gòu)并自我復(fù)制。EBV感染在世界各地呈現(xiàn)散發(fā)狀態(tài)，患者和EBV攜帶者為傳染源[7]。傳播途徑主要經(jīng)口密切接觸傳播，臨床表現(xiàn)多種多樣。青少年感染EBV后可有50%以上表現(xiàn)為傳染性單核細(xì)胞增多癥[8]。EBV具備逃避宿主免疫的能力，因此，出現(xiàn)宿主慢性EBV感染，干擾免疫功能，是免疫失調(diào)的觸發(fā)點(diǎn)，能夠在B淋巴細(xì)胞中隱性感染，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能紊亂，甚至通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞分化及凋亡，導(dǎo)致惡性淋巴組織增生，從而介導(dǎo)淋巴瘤的發(fā)生[9]，尤其伯基特淋巴瘤、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母T細(xì)胞淋巴瘤與NK/T淋巴瘤的發(fā)生關(guān)系密切。

SA Jo等[10]的研究顯示，既使低滴度的EBV DNA仍有導(dǎo)致細(xì)胞增生異常、惡變的可能。同時，EBV潛伏感染的時間長短可能比EBV DNA拷貝數(shù)更能預(yù)估疾病進(jìn)展，但是目前尚無可靠的檢測手段來判斷EBV感染的時間。動態(tài)監(jiān)測EBV DNA的變化可能是目前臨床上最可靠、簡便易行的檢測手段，因此在臨床廣泛使用。本次研究納入的患者均在每次入院時檢測EBV DNA水平，以期對疾病起到動態(tài)監(jiān)測的作用。

在淋巴瘤患者中，LDH與β2-MG的升高已被廣泛認(rèn)為與疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)[11]。LDH是一種糖酵解酶，在機(jī)體內(nèi)催化丙酮酸和乳酸之間的氧化還原反應(yīng)，是糖的無氧酵解及糖異生的重要酶系之一。腫瘤細(xì)胞內(nèi)合成及釋放增多，活性隨之增高，被認(rèn)為與腫瘤的代謝、增殖與浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)[12]，并可直接指導(dǎo)多種惡性腫瘤的預(yù)后判定。在淋巴瘤患者中，LDH的高表達(dá)直接影響淋巴瘤的發(fā)生與發(fā)展，并成為淋巴瘤臨床治療和觀察的獨(dú)立因素。在國際預(yù)后指數(shù)評分（IPI評分）中，LDH也作為一項(xiàng)獨(dú)立觀察對象位列其中。正常人體血內(nèi)β2-MG水平基本恒定，β2-MG容易通過腎小球?yàn)V過膜，幾乎全部由近曲小管以胞飲形式攝取。在排除肝臟、腎臟疾病和自身免疫性疾病后，β2-MG水平明顯增高提示淋巴瘤廣泛浸潤。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為β2-MG水平持續(xù)升高常提示病情進(jìn)展迅速或惡性程度較高，腫瘤經(jīng)過治療后β2-MG水平明顯下降者，預(yù)后較好[13]。

上述結(jié)論的另一例證就是相關(guān)研究已證實(shí)EB病毒與淋巴細(xì)胞增殖紊亂相關(guān)[14-15]，受EB病毒感染的淋巴細(xì)胞增殖能力變強(qiáng)，因此，EBV DNA水平也可反映EB病毒相關(guān)的淋巴瘤患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷。這些研究也說明EBV DNA可以成為淋巴瘤臨床療效預(yù)判和預(yù)后評估的可靠指標(biāo)。

目前在淋巴瘤患者中檢測EB病毒的方法主要有3種[16-17]，一種是通過病理組織活檢切片行原位雜交檢測EBER;二是檢測外周血EBV DNA;三是血清免疫學(xué)檢測EB病毒抗體。原位雜交技術(shù)檢測EBER被認(rèn)為是EB病毒檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其取材困難、操作復(fù)雜，難以在所有患者的每次返院治療、復(fù)查時推廣、實(shí)行，目前在臨床上主要用于病理診斷。外周血EBV DNA檢測手段方便易行，取材容易，是臨床工作中較為理想的動態(tài)監(jiān)測指標(biāo)。亦有研究顯示，EBER與EBV DNA存在良好的相關(guān)性[18]。

本研究收集了2013年1月～2016年12月福建省立醫(yī)院血液科收治的EB病毒陽性的淋巴瘤病例共46例，分析LDH、β2-MG與EBV DNA動態(tài)變化的關(guān)系，同時分析疾病轉(zhuǎn)歸與EBV DNA動態(tài)變化之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，EBV DNA的改變趨勢與LDH、β2-MG的改變趨勢有高度一致性，說明EBV的活動程度與腫瘤的活動程度有關(guān)。臨床療效與EBV DNA水平的關(guān)系評估也顯示，隨著EBV DNA的下降乃至轉(zhuǎn)陰，淋巴瘤患者的臨床療效明顯優(yōu)于EBV DNA水平上升的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明化療后外周血EBV DNA拷貝數(shù)變化與臨床療效及預(yù)后明顯相關(guān)。國外相關(guān)資料也顯示[19]，發(fā)病時外周血EBV陽性的淋巴瘤患者在治療后達(dá)到緩解時常伴有外周血EBV DNA水平的明顯下降或轉(zhuǎn)陰，而在疾病復(fù)發(fā)或進(jìn)展時大多存在EBV DNA拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)陽或明顯升高。在化療后外周血EBV DNA持續(xù)陽性的患者，往往提示療效不佳和不良預(yù)后[20]。本文統(tǒng)計結(jié)果亦表明，在EBV陽性的患者中，EBV DNA水平與淋巴瘤的活動、發(fā)展、療效及預(yù)后均存在密切關(guān)系;通過臨床動態(tài)檢測EBV DNA水平的活動，可以起到評估療效、判斷預(yù)后的作用。

上述結(jié)果說明，外周血EBV DNA檢測是一種易于獲取、簡便易行、結(jié)果穩(wěn)定、意義可靠的臨床指標(biāo)，可用于判斷淋巴瘤患者的預(yù)后，并在治療過程中進(jìn)行監(jiān)測，以評估其對治療的反應(yīng)、療效評價和疾病狀態(tài)等。由于本研究納入的病例數(shù)有限，且由于大規(guī)模臨床統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，不同類型的淋巴瘤在EB病毒攜帶、感染、治療反應(yīng)方面存在客觀上的差異[21]，因此，是否可以通過抗病毒等方式抑制EBV DNA拷貝數(shù)，從而起到移植淋巴瘤活動、進(jìn)展的療效，還有待進(jìn)一步的研究以證實(shí)。另外，本研究的觀察時間也較短，因此可能存在一定的不足，對總體生存率和無進(jìn)展生存率的觀察還需要更多病例、更長時間的觀察以確定。

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（收稿日期：2018-08-14）