免疫性血小板減少癥患者調(diào)節(jié)性B細(xì)胞數(shù)量及功能研究

張燕 壽黎紅

[摘要] 目的 研究免疫性血小板減少癥患者的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的數(shù)量和功能，為臨床醫(yī)師評(píng)估該類疾病患者的病情提供重要指導(dǎo)。 方法 以2016年10月～2018年7月本院接診的初診免疫性血小板減少癥患者40例為A組，另以本院同期接診的完全緩解免疫性血小板減少癥患者35例為B組，同時(shí)將同期接診的健康體檢者40名作為對(duì)照組，設(shè)為C組。采取流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組的外周血Bregs數(shù)量和白細(xì)胞介素-10表達(dá)量進(jìn)行檢測，同時(shí)對(duì)其檢測結(jié)果作出分析和比較。 結(jié)果 A組的外周血Bregs數(shù)量為（3.08±0.66）%，比B組以及C組的（5.45±0.82）%、（7.82±1.03）%低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。A組外周血Bregs中的白細(xì)胞介素-10細(xì)胞比例為（32.29±8.68）%，比B組及C組的（51.03±10.54）%、（71.88±12.28）%低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且B組外周血Bregs中的白細(xì)胞介素-10細(xì)胞比例比C組低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 免疫性血小板減少癥的發(fā)生與Bregs有著較為密切的關(guān)系，因此，臨床醫(yī)師可以將Bregs作為免疫性血小板減少癥的一個(gè)重要治療靶點(diǎn)，以進(jìn)一步提高患者病情控制的效果。

[關(guān)鍵詞] 白細(xì)胞介素-10;外周血Bregs數(shù)量;免疫性血小板減少癥;調(diào)節(jié)性B細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R558.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）36-0025-04

[Abstract] Objective To study the number and function of regulatory B cells in patients with immune thrombocytopenia， and to provide important guidance for clinicians to assess the condition of patients with such diseases. Methods A total of 40 patients with newly diagnosed immune thrombocytopenia who were admitted in our hospital from October 2016 to July 2018 were enrolled in the group A， and 35 patients with complete remission of immune thrombocytopenia who were admitted in the hospital at the same time were set as group B. 40 healthy subjects who were admitted at the same time were set as the control group（group C）. Flow cytometry was used to detect the number of peripheral blood Bregs and interleukin-10 expression in each group， and the results were analyzed and compared. Results The number of peripheral blood Bregs in group A was（3.08±0.66）%， which was lower than（5.45±0.82）% and（7.82±1.03）% in group B and group C. There was significant difference among the three groups（P<0.05）. The proportion of interleukin-10 cells in peripheral blood Bregs of group A was（32.29±8.68）%， which was significantly lower than（51.03±10.54）% and（71.88±12.28）% of group B and group C， with statistically significant difference（P<0.05）. And the proportion of interleukin-10 cells in peripheral blood Bregs of group B was lower than that of group C， and the difference between the groups was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The occurrence of immune thrombocytopenia is closely related to Bregs. Therefore， clinicians can use Bregs as an important therapeutic target for immune thrombocytopenia to further improve the patient's disease control.

[Key words] Interleukin-10; Number of peripheral blood Bregs; Immune thrombocytopenia; Regulatory B cells

免疫性血小板減少癥（Immune thrombocytopenia，ITP）是一種獲得性自身免疫性出血性疾病，約占出血性疾病總數(shù)的1/3，成人發(fā)病率約為（5～10）/10萬，育齡期女性發(fā)病率高于男性，60歲以上老年人是該病的高發(fā)群體。臨床以皮膚黏膜出血為主，嚴(yán)重者可有內(nèi)臟出血，甚至顱內(nèi)出血，出血風(fēng)險(xiǎn)隨年齡而增加。部分患者僅有血小板減少，沒有出血癥狀。目前已知的該病主要發(fā)病機(jī)制有：①體液和細(xì)胞免疫介導(dǎo)的血小板過度破壞;②體液和細(xì)胞免疫介導(dǎo)的巨核細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量異常，血小板生成不足。因此，免疫性血小板減少癥是一種血小板減少性疾病[1]，可對(duì)患者的身體健康造成比較大的影響。而已知B細(xì)胞的主要功能是介導(dǎo)體液免疫，因此常被認(rèn)為是免疫應(yīng)答的正向促進(jìn)因素。直到1974年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)將去除B細(xì)胞的脾細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移給豚鼠后，不能抑制其遲發(fā)型超敏反應(yīng)，首次證明了B細(xì)胞的負(fù)向免疫調(diào)控作用，該研究表明B細(xì)胞中存在一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞亞群，但其具體分子生物學(xué)機(jī)制并未深入闡述。直到1996年，Wolf等[2]在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，與有自愈傾向的野生型小鼠相比，EAE可使B細(xì)胞缺陷的C57BL/6小鼠疾病進(jìn)一步進(jìn)展，表明小鼠體內(nèi)可能存在抑制炎癥反應(yīng)的B細(xì)胞亞群。此后， 該群B細(xì)胞亞群引起研究者的廣泛關(guān)注。進(jìn)一步研究表明這群B細(xì)胞通過分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子（IL-10、TGF-β）等及細(xì)胞間接觸等方式作用于其他免疫細(xì)胞，從而抑制免疫應(yīng)答，這群B細(xì)胞稱為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Bregs）。相關(guān)資料中曾提及[3]，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞能夠通過對(duì)白細(xì)胞介素-10進(jìn)行分泌的方式，發(fā)揮其抑制免疫應(yīng)答的作用。若Bregs缺失與（或者）功能減弱，將會(huì)引發(fā)自身免疫性疾病，并能在一定程度上加重患者的病情[4]。故而，通過對(duì)免疫性血小板減少癥患者的Bregs數(shù)量和功能進(jìn)行檢測，可為其病情程度的判斷提供幫助并有助于指導(dǎo)治療[5]。此研究中，本文將著重分析免疫性血小板減少癥患者的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的數(shù)量與功能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年10月～2018年7月就診于湖州市中心醫(yī)院初診為免疫性血小板減少癥的患者40例，作為A組，其中男21例，女19例;年齡25～70歲，平均（38.24±5.16）歲;血小板計(jì)數(shù)低于100×109/L。2016年10月～2018年7月期間本院接診的完全緩解免疫性血小板減少癥患者35例作為B組，其中男19例，女16例;年齡24～71歲，平均（39.02±5.84）歲;血小板計(jì)數(shù)為（100～300）×109/L。2016年10月～2018年7月期間本院接診的健康體檢者40名作為C組，其中男22例，女18例;年齡24～72歲，平均（38.97±5.46）歲。所有入選者均簽署知情同意書，有完整的臨床資料，依從性良好，獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。此研究排除依從性較差者、中途退出試驗(yàn)者以及未簽署知情同意書者。各組的就診時(shí)間以及性別構(gòu)成比等基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

（1）所用試劑和儀器。鼠抗人CD24抗體（經(jīng)PE標(biāo)記）、鼠抗人CD38抗體（經(jīng)APC標(biāo)記）、鼠抗人CD19抗體（經(jīng)FITC標(biāo)記）由“美國Becton Dickinson公司”提供，鼠抗人白細(xì)胞介素-10（經(jīng)PerCP-Cy5.5標(biāo)記）由“美國Biolegend公司”提供，各抗體的同型對(duì)照、破膜劑和溶血素由“美國BD公司”提供，F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀由“美國BD公司”提供。

（2）采取流式細(xì)胞術(shù)對(duì)外周血Bregs數(shù)量進(jìn)行檢測。取各組的外周靜脈血約10 μL，經(jīng)EDTA抗凝處理后，向血液標(biāo)本中分別加入20 μL的鼠抗人CD38抗體、鼠抗人CD19抗體以及鼠抗人CD24抗體，并將之置于4℃的環(huán)境中進(jìn)行孵育，待15 min之后再加入溶血素（1 mL）。避光放置10 min后，進(jìn)行離心處理，控制離心時(shí)間為5 min，此后，再利用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌，并按要求加入磷酸鹽緩沖液，用量為300 μL。利用流式細(xì)胞儀對(duì)3萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)Bregs數(shù)量進(jìn)行檢測。

（3）采取流式細(xì)胞術(shù)對(duì)外周血Bregs功能分子分泌的白細(xì)胞介素-10的數(shù)量進(jìn)行檢測。取各組的外周靜脈血約200 μL，經(jīng)EDTA抗凝處理后，在血液標(biāo)本中分別加入20 μL的鼠抗人CD38抗體、鼠抗人CD19抗體、鼠抗人CD24抗體與同型對(duì)照。于4℃的環(huán)境下進(jìn)行避光孵育，待15 min之后再加入1 mL的溶血素，于避光放置10 min后進(jìn)行離心處理，控制離心時(shí)間為5 min。此后，再加入600 μL的破膜劑，于室溫且避光的環(huán)境中進(jìn)行保存，10 min后，利用磷酸鹽緩沖液（1 mL）進(jìn)行洗滌，然后再分別加入5 μL的鼠抗人白細(xì)胞介素-10抗體與同型對(duì)照。于4℃、避光的環(huán)境下進(jìn)行孵育，15 min后，經(jīng)磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌后，加入磷酸鹽緩沖液300 μL。利用流式細(xì)胞儀對(duì)5萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)Bregs細(xì)胞中的白細(xì)胞介素-10的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

1.3 治療方法和療效判斷標(biāo)準(zhǔn)

針對(duì)此研究中所納入的免疫性血小板減少癥患者，均予以糖皮質(zhì)激素治療，潑尼松的每日用藥量為1 mg/kg，并根據(jù)患者的病情狀況，對(duì)部分患者輔以重組人血小板生成素與丙種球蛋白治療，其中，重組人血小板生成素的每日用藥量為300 IU/kg，連續(xù)治療14 d，丙種球蛋白的每日用藥量為400 mg/kg，連續(xù)治療5 d。而免疫性血小板減少癥的診斷和治療效果判斷均參考《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[6]中的相關(guān)內(nèi)容。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

對(duì)A、B、C三組的檢測結(jié)果進(jìn)行分析和比較，包括外周血Bregs數(shù)量和功能以及外周血Bregs中白細(xì)胞介素-10的細(xì)胞比例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究所有數(shù)據(jù)均采取SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bregs數(shù)量分析

A組的Bregs數(shù)量比B、C兩組低，組間差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 外周血Bregs中白細(xì)胞介素-10細(xì)胞比例分析

A組Bregs水平、外周血Bregs中白細(xì)胞介素-10細(xì)胞比例均低于B組與C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），同時(shí)B組Bregs水平、外周血Bregs中白細(xì)胞介素-10細(xì)胞比例低于C組健康體檢者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

迄今為止，臨床上還尚未能研究出免疫性血小板減少癥的確切病因[7]，但有報(bào)道稱，異常B淋巴細(xì)胞形成抗體乃免疫性血小板減少癥的一個(gè)重要致病環(huán)節(jié)[8]。而Bregs則是機(jī)體免疫系統(tǒng)中比較重要的一個(gè)組成部分，其能夠分泌白細(xì)胞介素-10，并由此起到對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行負(fù)向免疫調(diào)節(jié)的作用，而Bregs數(shù)量的減少和功能的失調(diào)則極有可能會(huì)引發(fā)自身免疫性疾病，亦或者是加重患者的病情[9-11]。白細(xì)胞介素-10能夠?qū)腡h0細(xì)胞分化成為Th2細(xì)胞的過程進(jìn)行誘導(dǎo)，可抑制CD4+T細(xì)胞向Th1、Th17細(xì)胞分化，同時(shí)可抑制Th1、Th17細(xì)胞的活化和分化，使得Th1/Th2失去平衡，促使CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞和Tr1細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并能夠?qū)渫粻罴?xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素-6以及白細(xì)胞介素-12的分泌過程進(jìn)行有效的抑制[12-15]。相關(guān)資料中提及[16]，對(duì)于免疫性血小板減少癥患者來說，其Th17細(xì)胞數(shù)量明顯增加，Th1/Th2出現(xiàn)極化異常的情況，且調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平明顯降低。雖然IL-10是Bregs參與抑制免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞因子，但仍有一些其他因子，如TGF-β、IL-35、CD1d、CD80、CD86、PD-L1、CTLA-4、IDO、IgG4等參與輔助Bregs與其他免疫細(xì)胞相互作用，進(jìn)而使Bregs發(fā)揮抑制免疫應(yīng)答的功能[17]。

本研究中，A組的Bregs數(shù)量比B、C兩組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;A組外周血Bregs中白細(xì)胞介素-10的細(xì)胞比例比B、C兩組低，組間差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;B組外周血Bregs中白細(xì)胞介素-10的細(xì)胞比例比C組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。由此說明，免疫性血小板減少癥的發(fā)生、發(fā)展過程當(dāng)中，Bregs起著至關(guān)重要的作用，在臨床治療中，通過提高患者的Bregs水平及相關(guān)功能，有助于更好地緩解患者的病情，改善預(yù)后效果。

mDC能夠?qū)h1免疫應(yīng)答進(jìn)行誘導(dǎo)，可加快細(xì)胞免疫發(fā)生的速度[18]。pDC和mDC能夠通過分泌出的細(xì)胞因子進(jìn)行相互抑制，對(duì)于免疫性血小板減少癥患者來說，其機(jī)體中的pDC水平明顯增加，從而對(duì)mDC進(jìn)行有效的抑制，使得mDC水平明顯降低[19]，表明mDC在免疫性血小板減少癥的發(fā)生過程中可能起到了一定的推動(dòng)作用[20]。相關(guān)資料中提及，對(duì)于免疫性血小板減少癥患者來說，其Bregs和mDC為正相關(guān)的關(guān)系，表明Bregs和mDC有可能均參與免疫性血小板減少癥的免疫病理過程;Bregs和外周血血小板計(jì)數(shù)表現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系，表明Bregs水平和免疫性血小板減少癥的發(fā)生與進(jìn)展有著較為密切的關(guān)系。

Bregs的發(fā)現(xiàn)為研究免疫性血小板減少癥開辟了一個(gè)新的領(lǐng)域。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫性血小板減少癥患者的Bregs數(shù)量和功能較完全緩解患者和健康人群均有明顯降低，且同疾病的嚴(yán)重程度有著較為密切的關(guān)系。在免疫性血小板減少癥的發(fā)生機(jī)制中，Bregs有著比較顯著的推動(dòng)作用，通過對(duì)Bregs數(shù)量和功能進(jìn)行檢測，能夠?yàn)榕R床醫(yī)師評(píng)估免疫性血小板減少癥患者的病情及預(yù)后提供新的評(píng)判指標(biāo)，且該研究結(jié)果有助于在臨床工作中通過檢測免疫性血小板減少癥患者的Bregs數(shù)量及功能變化，更全面地評(píng)估患者療效，同時(shí)為臨床未來靶向治療該疾病提供新的方向。

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（收稿日期：2018-09-25）