扁桃蔗糖合成酶對幼果生理脫落的響應(yīng)研究

郭春苗，朱正陽，木巴熱克·阿尤普，許 娟，肖 麗，龔 鵬，楊 波

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】扁桃(AmygdaluscommunisL.)，薔薇科李亞科桃屬扁桃亞屬植物，是世界著名珍貴干果樹種，新疆喀什地區(qū)是我國扁桃的唯一主產(chǎn)區(qū)，栽培面積超過了百萬畝，扁桃生產(chǎn)已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。扁桃的栽培生產(chǎn)中調(diào)查發(fā)現(xiàn)，幼果生理脫落現(xiàn)象嚴重影響產(chǎn)量。果樹的幼果生理脫落。研究扁桃蔗糖合成酶基因功能與幼果生理落果的關(guān)系?！厩叭搜芯窟M展】前人研究發(fā)現(xiàn)，糖代謝是影響幼果生理脫落的重要因素[2]。國外內(nèi)外學(xué)者在蘋果[3]、梨、蜜桔[4]、柑橘、龍眼[6]等各個南北方樹種上探討了樹體糖代謝與開花坐果的關(guān)系密切相關(guān)[3-9]。而糖代謝途徑中蔗糖代謝是最主要的途徑，處于中心位置，其合成積累及分解受多種酶的調(diào)控，其中主要由蔗糖合成酶(Sucrose Synthase，EC2.4.1.13，SuSy)和轉(zhuǎn)化酶(Invertase, EC3.1.2.26, Inv)調(diào)節(jié)其分解與合成，使庫源保持一定的蔗糖濃度梯度，影響蔗糖運輸，因而SuSy和Inv活性的改變直接影響庫強。在甜橙等果樹中，在果實發(fā)育早期，SuSy是影響甜橙果實庫強的主要因子[10]，這一點在番木瓜[11]上也有證實。Chengappa等[12]也在轉(zhuǎn)基因番茄植株幼果上發(fā)現(xiàn)SuSy有調(diào)控果實輸入蔗糖的多少和代謝蔗糖的能力，并且SuSy既具有可催化蔗糖合成又具有可催化蔗糖分解的能力，故在蔗糖代謝中起著極其重要作用。目前國外研究者已經(jīng)成功地將SuSy基因從馬鈴薯、甜菜、胡蘿卜、水稻、玉米和甘蔗等作物中克隆出來[13]。D’Aoust等[14]研究轉(zhuǎn)基因番茄更是得出SuSy有影響果實坐果和發(fā)育能力的結(jié)論。而最為干果的扁桃與其他樹種不同的是，該樹種春季先開花，而后葉片、新梢、果實同期迅速生長，加之新生幼嫩葉片行使光合作用功能有限，無法通過合成有機質(zhì)補充樹體所需養(yǎng)分，這種營養(yǎng)競爭形成了碳水化合物尤其是糖代謝變化，造成幼果生理脫落，幼果生理脫落一般持續(xù)40 d(盛花后第7～47 d)[15]。【本研究切入點】目前扁桃的蔗糖合成酶特性鮮見報道，該酶在扁桃果實生長發(fā)育過程中的作用及其與幼果脫落的關(guān)系也尚不明確。研究扁桃蔗糖合成酶對幼果生理脫落的響應(yīng)研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究以新疆主栽扁桃品種‘紙皮’為試材，選取幼果生理脫落期的7個時期采樣(正常果和即將脫落果)，以qRT-PCR分析扁桃幼果脫落期SuSy基因在正常果和即將脫落果中的表達模式，高效液相色譜測定幼果生理脫落期正常果和即將脫落果糖組分含量，分析蔗糖合成酶活性變化規(guī)律，以及表達量與相關(guān)糖酶活性及糖組分間的關(guān)系，闡明蔗糖合成酶在扁桃幼果發(fā)育期糖積累過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗果園位于新疆喀什莎車縣托木斯塘鄉(xiāng)11村，供試品種為紙皮扁桃(AmygdaluscommunisL.cv.ZhiPi) ，2001年定植，株行距(6×7) m，中等樹勢，正常管理，隨機標記長勢一致的30株采樣株用于研究田間采樣。于春季紙皮扁桃開花前，在每株樹冠外圍東南西北四個方向選擇掛果量較一致的結(jié)果枝進行標記、掛牌、編號，每株掛牌30個結(jié)果枝，用于取不同時期果實樣品進行酸性轉(zhuǎn)化酶的表達模式、糖組分和酶活測定分析。在幼果生理脫落期(盛花后12～42 d)內(nèi)動態(tài)采樣，自4月10日起每隔5 d取正常果實和即將脫落果1次，共計7次(“即將脫落果”辨別特征：在結(jié)果枝上緩慢生長暫未脫落，手指輕觸果實即可脫落，果個明顯比同期生長的正常果實小、果柄細，但明顯比前一個采樣點也即5 d前的即將脫落果實大，掛果若干天后逐漸萎縮并脫落)。于11:00從標記的30株取樣株上選取發(fā)育正常的果實30～50 個，即將脫落果實30～50個，置于冰壺中立即帶回實驗室。樣品用去離子水清洗干凈液氮速凍后于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

植物總RNA提取試劑盒TransZol UP、First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、DNA Marker、Tip Green qPCR SuperMix由寶生物工程有限公司提供；引物和基因測序服務(wù)由上海生工生物科技有限公司提供；糖組分測定標準品及酶活性測定等其它常規(guī)生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1SuSy基因的表達

以紙皮扁桃幼果生理脫落期的正常果和即將脫落果為試驗材料，采用TransZol UP試劑盒提取果實總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop 2000C分光光度計檢測RNA純度及濃度，檢測RNA濃度和質(zhì)量后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，用于目標基因表達模式分析。

根據(jù)前期克隆得到的紙皮扁桃SuSy基因全長序列設(shè)計qRT-PCR 引物，分別以盛花后12、17、22、27、32、37和42 d的紙皮扁桃正常果和即將脫落果的cDNA為模板，以Prunus persica ubiquitin為內(nèi)參，按照TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒中的方法，利用羅氏LightCycler96熒光定量PCR儀，檢測SuSy基因在正常果和即將脫落果在幼果脫落期的表達模式。

20 μL實時熒光定量PCR反應(yīng)體系包括：2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL、cDNA模板2 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序為: 95℃ 15 min預(yù)變性，55個循環(huán)(變性95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s)，從40℃升溫到99℃的熔解過程。每個樣品進行3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)，取3次重復(fù)試驗的平均值，運用CT法(2-ΔΔCt)分析SuSy基因相對于內(nèi)參基因的表達變化趨勢。表1

表1 引物序列
Table 1 Sequences of primers

引物名稱Primername引物序列 Primer sequence(5’→3’)正向 Forword反向 ReverseReal-SUSY-S & Real-SUSY-ASAGTTCCTTTTAGATCGGAGATAAGCCAACAAAGATGCAACUbiquitin -s & Ubiquitin -asTGCGTCTGAGGGGTGGTAATAGTCGGCCAGAGTCCTTC

1.2.2 糖組分及酶活性測定

紙皮扁桃幼果生理落果期果實中蔗糖、葡萄糖、果糖積累水平的動態(tài)變化測定采用高效液相色譜法，參照張麗麗等[16]方法，濃度的單位為mg/g FW；酶液制備參考KELLER F[17](1993)的方法；蔗糖合成酶(SuSy)活性測定參照MIRON[18]的方法，酶的活性單位為mg/(h·g) FW。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果統(tǒng)計分析采用DPS 9.50 和Excel 2010 統(tǒng)計分析軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SuSy基因在幼果生理脫落期的表達

研究表明，SuSy基因在幼果生理脫落期中各時期均有表達，但在正常果與即將脫落果中表達不盡一致。SuSy基因的表達量在正常果中呈現(xiàn)前期緩慢降低，中期大幅升高而后期又下降的趨勢；而在即將脫落果中呈現(xiàn)前期降低，中期升高而后降低至最低值，后期陡然又升高的趨勢。

正常果與即將脫落果在花后12 d至花后17 d均呈現(xiàn)降低趨勢，而不同的是，正常果的降低趨勢一直持續(xù)到花后第27 d，即將脫落果則在花后17 d至花后27 d呈緩慢上升狀態(tài)；花后27 d后，正常果SuSy基因的表達量快速增加，至第37 d達到峰值，然后降低趨于平緩，即將脫落果的SuSy基因的表達量則在第27 d開始減少，至第37 d達到最低值，而后陡升趨于平緩。

縱觀整個幼果生理脫落期(花后第7～47 d)，除第22～27 d的即將脫落果SuSy基因的表達量高于正常果，其他時期正常果實的SuSy基因表達量均高于即將脫落果。正常果的SuSy基因總表達量在幼果生理脫落前期(花后第7～27 d)較幼果生理脫落后期(花后第27～47 d)低，而即將脫落果的SuSy基因總表達量在幼果生理脫落前期(花后第7～27 d)較幼果生理脫落后期(花后第27～47 d)高。

在扁桃幼果生理脫落的7個時期，正常果和即將脫落果中SuSy的表達存在著差異性，SuSy基因表達量的變化規(guī)律也從側(cè)面反應(yīng)出正常果和落果的果實內(nèi)部糖代謝差異現(xiàn)象，與落果規(guī)律[10]基本吻合，可推測SuSy基因參與調(diào)節(jié)植物抗逆并感知糖信號進而調(diào)節(jié)糖組分含量來響應(yīng)落果。圖1

圖1 紙皮扁桃果實SuSy基因生理落果期表達模式
Fig.1 SuSy gene expression of ‘zhipi’Almond in physiological furit drop period

2.2 生理落果期果實糖組分含量的動態(tài)變化

研究表明，正常果和即將脫落果中蔗糖的濃度均表現(xiàn)為逐步緩慢升高的趨勢；即將脫落果中的蔗糖濃度始終大于正常果，其中盛花后12、32 d正常果和即將脫落果間差異達顯著水平；即將脫落果中蔗糖濃度的低值出現(xiàn)在落果高峰期(盛花后第22 d)；正常果和即將脫落果中葡萄糖的濃度總體呈現(xiàn)為逐步升高的趨勢，但正常果中葡萄糖積累的速度明顯大于即將脫落果(正常果中平均含量為26.44 mg/g FW，即將脫落果中為12.55 mg/g FW)；果實中果糖的變化趨勢與葡萄糖相似，正常果中果糖的濃度呈明顯的上升趨勢，而即將脫落果中果糖積累速度十分緩慢(正常果中平均含量為6.65 mg/g FW，即將脫落果中為2.20 mg/g FW)。

在扁桃果實膨大的過程中，扁桃果實中蔗糖、葡萄糖和果糖是不斷積累的過程，且葡萄糖﹥果糖﹥蔗糖，說明幼果發(fā)育期葡萄糖起主要作用；即將脫落果中的蔗糖濃度始終大于正常果，而即將脫落果中的葡萄糖和果糖則顯著低于正常果實，說明即將脫落果中的蔗糖還未來得及轉(zhuǎn)化為葡萄糖、果糖等就已發(fā)生脫落。圖2

圖2 紙皮扁桃果實生理落果期糖組分含量
Fig.2 Content of sugar of zhipi Almond in physiological furit drop period

2.3 生理落果期果實SuSy酶活性的動態(tài)變化

2.3.1 生理落果期果實SuSy分解方向酶活的動態(tài)變化

研究表明，在整個扁桃生理落果期，正常果和即將脫落果的SuSy分解方向酶活性總體均呈現(xiàn)一致的反復(fù)波動趨勢，且在整個扁桃生理落果期正常果實的SuSy分解方向酶活性始終高于即將脫落果；在生理落果初期(盛花后7～17 d)，正常果與即將脫落果中SuSy分解方向酶活性均呈現(xiàn)上升的趨勢且盛花后17 d分別達到其峰值(正常果為50.83 mg/(h·g) FW，即將脫落果為46.89 mg/(h·g) FW)，而后至27 d則呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，再在盛花后第27～32 d經(jīng)歷小幅度上升后，至第37 d又下降，最后緩慢升高至生理落果期結(jié)束；在即將達到生理落果高峰期(盛花后第17～22 d)時，二者SuSy分解方向酶活性均呈總體下降趨勢；快速脫落期(盛花后7～22 d)正常果和即將脫落果的SuSy分解方向酶活性明顯高于緩慢脫落期(盛花后第 22～47 d)。

SuSy分解方向酶活性在果實發(fā)育初期及幼果脫落前期活性較高，說明該時期該分解方向酶具有分解蔗糖供給組織生長提供碳源的作用，有抵抗幼果脫落的抗逆行為。而隨著生長發(fā)育以及幼果生理脫落期的推移，扁桃果實膨大，SuSy分解方向酶活性逐漸降低趨于平緩，使蔗糖得以積累。在快速脫落期，正常果和即將脫落果中SuSy分解方向酶活性變化幅度較大，而在緩慢脫落期該酶活性則變化較小且趨于平緩；該分解方向酶活性在落果前期(盛花后第17 d)正常果和即將脫落果中均達峰值，而隨著落果高峰期(盛花后第22 d)的到來活性下降，說明生理落果前期果實內(nèi)部該分解方向酶積極響應(yīng)蔗糖分解提供能量，參與果實脫落抗逆活動，變化趨勢與落果規(guī)律趨于吻合，證實SuSy分解方向酶活性與扁桃果實脫落有著密切關(guān)系。圖3

圖3 生理落果期果實中SuSy分解方向酶活性的動態(tài)變化
Fig.3 The dynamic changes ofSuSy’sdecomposition activities in fruit

2.3.2 生理落果期果實SuSy合成方向酶活的動態(tài)變化

研究表明，在整個扁桃生理落果期，正常果和即將脫落果的SuSy合成方向酶活性波動趨勢不盡相同。除盛花后12～17 d即將脫落果SuSy合成方向酶活性有明顯的升高外，后續(xù)時期正常果與即將脫落果SuSy合成方向酶活性變化趨勢較為一致；正常果和即將脫落果的SuSy合成方向酶活性極顯著差異產(chǎn)生在盛花后第17 d(即將到達落果高峰第22 d)；在生理落果的快速脫落期間(盛花后7～22 d)，正常果的SuSy合成方向酶活性始終持下降趨勢，而即將脫落果的SuSy合成方向酶活性在12～17 d有小幅上升后，自17 d后變化與正常果一致，均呈現(xiàn)下降的趨勢且持續(xù)到盛花后第27 d；緩慢脫落期(盛花后23～47 d)較快速脫落期(盛花后7～22 d)，正常果和即將脫落果的SuSy合成方向酶活性較低，均有小幅波動，最后穩(wěn)定至生理落果期結(jié)束。

在扁桃幼果生理脫落前期，正常果實的SuSy合成方向酶活性是下降的，而即將脫落果實的SuSy合成方向酶活性則是上升的，說明該時期正常果實SuSy合成方向是受抑制的，SuSy在這一階段主要行使分解蔗糖的功能，響應(yīng)糖組分的代謝以此來供給組織生長的需要，這有利于組織成熟從而抵抗幼果的脫落。隨著果實生長發(fā)育日益成熟，光合作用加強，SuSy合成方向酶活性有回升并趨于平緩，使蔗糖合成增加?？梢园l(fā)現(xiàn)，在幼果生理脫落前期果實內(nèi)是抑制SuSy合成方向酶活性的，可推測果實通過糖代謝機制調(diào)控SuSy活性來積極預(yù)防幼果脫落，分析正常果和即將脫落果的SuSy合成方向酶活性變化趨勢與落果規(guī)律基本吻合，說明SuSy合成方向酶活性與扁桃果實脫落之間存在內(nèi)部聯(lián)系。圖4

圖4 生理落果期果實中SuSy合成方向酶活性的動態(tài)變化
Fig.4 The dynamic changes ofSuSy’ssynthesis activities in fruit

3 討 論

蔗糖合成酶是促使蔗糖進入各種代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，在果樹糖代謝途徑中占有很重要的地位。研究表明，SuSy不但影響植物的產(chǎn)量、蔗糖成分和淀粉含量、植物品質(zhì)，還參與植物非生物脅迫等過程，一般認為SuSy主要起分解蔗糖的作用，為多糖、細胞壁和淀粉合成提供前體和底物，雖然有關(guān)植物蔗糖代謝的生化過程已基本清楚，但其內(nèi)在分子機理仍在探索中[19]。研究通過對扁桃SuSy基因qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)不論是在正常果還是即將脫落果中，SuSy基因在各時期都有表達，而且表達量隨著幼果脫落規(guī)律發(fā)生著相應(yīng)變化，這一點與學(xué)者在蜜柑[20]、臍橙[21]、桃[22]等果樹上的研究結(jié)果一致。

在研究中，幼果快速脫落期(盛花后7～22 d)，正常果SuSy表達量自盛花后第12 d始隨著果實發(fā)育持續(xù)走低，至盛花后第27 d表達量達最低值，而即將脫落果的SuSy表達量自花后22 d開始回升，結(jié)合觀察糖組分的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)在這一時期所有樣品中，葡萄糖濃度﹥果糖濃度﹥蔗糖濃度，且正常果的葡萄糖和果糖濃度均大于即將脫落果的葡萄糖和果糖濃度，正常果的蔗糖濃度小于即將脫落果的蔗糖濃度，說明由于扁桃是先開花，而后果葉同期迅速生長，需要消耗大量養(yǎng)分，在幼葉成長為功能葉之前，果葉存在營養(yǎng)競爭關(guān)系，二者都是扮演“庫”的角色，需要大量還原糖(即葡萄糖和果糖)供能，樹體為抵制競爭引發(fā)的幼果脫落而會抑制蔗糖的合成，SuSy受營養(yǎng)脅迫表達量降低，與此同時即將脫落果的持續(xù)降低的SuSy合成方向酶活性也恰達最低值，而SuSy分解方向酶活開始回升，因此，推測在幼果快速脫落期也即營養(yǎng)競爭較為激烈的時期SuSy能識別糖信號并主要行使分解蔗糖功能，這也與趙智中[20]、張春華[22]、Elling[23]等研究一致。隨著時間推移營養(yǎng)競爭愈加明顯，至盛花后第27 d達到最激烈的節(jié)點，此節(jié)點營養(yǎng)脅迫導(dǎo)致了正常果中SuSy基因的最低表達。在幼果緩慢脫落期(盛花后23～47 d)，正常果中的SuSy基因量表達開始回升，至花后第32 d達峰值，后下降平緩至落果期結(jié)束，而即將脫落果中的SuSy基因表達量小幅回升，至花后第32 d達谷值，后回升平緩至落果期結(jié)束；同時在所有樣品中SuSy酶活性較幼果快速脫落期是降低的且呈波動下降趨勢；結(jié)合觀察這一時期糖組分變化發(fā)現(xiàn)葡萄糖、果糖濃度仍遠大于蔗糖濃度，且正常果葡萄糖、果糖濃度仍遠大于即將脫落果的葡萄糖、果糖濃度。但是蔗糖濃度自花后22 d開始回升，即將脫落果中蔗糖濃度大于正常果中蔗糖濃度?？梢钥闯?，扁桃在渡過其幼果生理快速脫落期后，幼嫩葉片逐漸成長為功能葉，葉片會實現(xiàn)從“庫”至“源”的角色轉(zhuǎn)變，幼果和新葉之間的營養(yǎng)競爭逐漸減輕，SuSy基因表達量得以回升，分解方向的酶活降低，合成方向酶活回升，使得蔗糖的分解程度減輕，果實開始積累蔗糖，這也與前人研究較為吻合[5,6,8]。此外，即將脫落果中的葡萄糖和果糖濃度顯著低于正常果，而蔗糖濃度卻高于正常果也說明即將脫落果中的蔗糖還未來得及轉(zhuǎn)化為葡萄糖、果糖等就已發(fā)生脫落。

4 結(jié) 論

扁桃蔗糖合成酶是貫穿整個扁桃幼果生理脫落過程中的關(guān)鍵酶，具有參與調(diào)節(jié)果實糖組分以及響應(yīng)脫落作用，在扁桃幼果生理脫落期間SuSy酶主要在分解方向上起作用，但即將脫落果的蔗糖分解代謝相對于正常果出現(xiàn)了異常造成部分果實糖代謝紊亂導(dǎo)致脫落。

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