臨床腹瀉患者艱難梭菌的感染情況和分子流行特征

馮雪君 徐少毅 吳曉燕

[摘要] 目的 了解臨床腹瀉患者艱難梭菌的感染情況和分子流行特征，為控制醫(yī)院感染和臨床診療提供依據(jù)。方法 收集2016年1～12月浙江省嘉興市第二醫(yī)院臨床腹瀉患者糞便標(biāo)本852份作為實(shí)驗(yàn)組，同期健康體檢成人糞便標(biāo)本310份作為對照組，厭氧培養(yǎng)獲得艱難梭菌的陽性率，并結(jié)合毒素基因型和多位點(diǎn)序列分型進(jìn)行綜合分析。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組852份糞便標(biāo)本中共分離到108株艱難梭菌，陽性率為12.68%，而對照組310份糞便標(biāo)本分離到8株，陽性率為2.58%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；實(shí)驗(yàn)組以tcdA+tcdB+菌株為主，占86.11%（93/108），tcdA-tcdB+菌株占5.56%（6/108），tcdA-tcdB-菌株占8.33%（9/108），產(chǎn)毒率為91.67%，而對照組對應(yīng)毒素基因型別占比為62.50%（5/8），12.50%（1/8），25.00%（2/8），產(chǎn)毒率為75.00%，但兩組產(chǎn)毒率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；實(shí)驗(yàn)組多位點(diǎn)序列分型發(fā)現(xiàn)32種ST型，其中ST54是相對流行的型別，另外CC48是相對流行的克隆群。 結(jié)論 臨床腹瀉患者艱難梭菌的感染率較高，亟需引起臨床重視并加強(qiáng)院感防控，預(yù)防暴發(fā)流行。

[關(guān)鍵詞] 艱難梭菌；毒素基因；多位點(diǎn)序列分型；eBURST分析

[中圖分類號] R446 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（a）-0161-04

艱難梭菌（Clostridium difficile，CD）屬于革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，其芽孢能在環(huán)境下生存較長時(shí)間，并能抵抗多種理化因素，是院內(nèi)重要的感染病原菌[1-2]。艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的癥狀表現(xiàn)不一，輕者引起腹瀉，嚴(yán)重者引發(fā)偽膜性腸炎，且常伴有中毒性巨結(jié)腸、腸穿孔、感染性休克等并發(fā)癥，甚至最終導(dǎo)致死亡[3-5]。研究表明，CDI的發(fā)病率已經(jīng)高于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）引起的感染，成為院內(nèi)感染首要病因[6-7]，但我國迄今為止尚未有針對CDI診斷和治療的指南、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出臺。本文旨在通過了解臨床腹瀉患者CDI情況，并結(jié)合毒素基因檢測和多位點(diǎn)序列分型揭示其毒力和親緣關(guān)系特征，為臨床針對性治療和院感防控提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2016年1～12月浙江省嘉興市第二醫(yī)院（以下簡稱“我院”）臨床腹瀉患者852例為實(shí)驗(yàn)組，其中男487例，女365例；年齡18～101歲，平均（65.45±16.48）歲。納入同期到我院進(jìn)行健康體檢的310名成人為對照組，其中男192名，女118名；年齡21～78歲，平均（46.21±14.38）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者近期出現(xiàn)腹瀉，排便次數(shù)增多（>3次/d），可伴大便性狀改變，可合并發(fā)熱（>38℃）或腹痛、外周血白細(xì)胞升高。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡<18歲；病因明確的感染性腹瀉（沙門、志賀菌、輪狀、諾如病毒等）；腸功能性疾病，如腸易激綜合征等；其他病因明確的腹瀉，如藥物性腹瀉、乳糖不耐受等。

1.2 主要儀器與試劑

厭氧培養(yǎng)箱（YQX-Ⅱ型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；全自動(dòng)微生物分析儀（VITEK-Compact2，法國Biomerieux有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（ABI7500型，美國Applied Biosystems有限公司）；電泳儀（DYY-5型，北京六一儀器廠）；凝膠成像儀（ChemiDoc XRS，美國Bio-Rad有限公司）；艱難梭菌顯色平板（法國Biomerieux有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 糞便標(biāo)本采集和處理 采集所有研究對象糞便標(biāo)本各1份。所有標(biāo)本經(jīng)75%乙醇預(yù)處理2 h后，接種艱難梭菌顯色平板，厭氧箱培養(yǎng)48 h，取黑色粗糙、有特殊氣味的菌落經(jīng)VITEK-Compact2全自動(dòng)微生物分析儀鑒定并分離后獲取艱難梭菌菌株。

1.3.2 艱難梭菌感染的臨床腹瀉患者相關(guān)臨床資料收集 查詢臨床病歷，統(tǒng)計(jì)艱難梭菌感染的臨床腹瀉患者近1個(gè)月的抗生素使用情況，并按抗生素的數(shù)量、種類或者疾病進(jìn)行整理歸類。

1.3.3 毒素基因檢測 挑取3～4個(gè)CD菌落制成菌懸液，嚴(yán)格按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取艱難梭菌的DNA，參考Persson等[8]的研究方法中引物序列來擴(kuò)增毒素基因tcdA和tcdB。PCR反應(yīng)體系為采用25 μL體系，包括Premix Ex Taq HS 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15 min，94℃ 30 s，54℃ 40 s和72℃ 40 s共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增的毒素基因條帶。

1.3.4 多位點(diǎn)序列分型（MLST） 采用Griffiths等[9]的研究方法，對艱難梭菌7個(gè)管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi）進(jìn)行擴(kuò)增，直接對產(chǎn)物進(jìn)行測序，將得到的測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得7個(gè)管家基因的等位基因號，并形成相應(yīng)的等位基因譜，判斷其序列型（sequence type，ST）。

1.3.5 eBURST分析 用eBURST v3（http：//eburst.mlst.net/）軟件分析菌株間的親緣關(guān)系，對比標(biāo)準(zhǔn)庫中的菌株（http：//pubmlst.org/clostridium difficile），把實(shí)現(xiàn)組所有ST型別進(jìn)行克隆群（clonal complex）、組（groups）和單體（singletons）的歸類。默認(rèn)7個(gè)等位基因條件下，如果有6個(gè)相同則屬于一個(gè)分型組（group），當(dāng)組內(nèi)有3個(gè)或3個(gè)以上的ST型，且其中一個(gè)ST擁有與之相應(yīng)的最多數(shù)量的單位點(diǎn)突變（single locus variant，SLV），那么該ST可以暫定為該組的始祖ST（founder），該組即可定義為一個(gè)克隆群，不能被歸類到任何組的ST命名為單體。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)輸入Excel表格中，進(jìn)行分類匯總，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 艱難梭菌的分離情況

實(shí)驗(yàn)組852份糞便標(biāo)本中共分離到108株CD，陽性率為12.68%，對照組310份糞便標(biāo)本分離到8株CD，陽性率為2.58%，兩組艱難梭菌的陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=25.78，P < 0.05）。

2.2 艱難梭菌感染的臨床腹瀉患者抗生素使用情況

108例CDI的臨床腹瀉患者中，1個(gè)月之內(nèi)使用過1種或者2種抗生素的腹瀉患者數(shù)量最多，占49.07%（53/108），使用3種及3種以上的抗生素的患者占26.85%（29/108），主要集中在ICU病房，總體抗生素使用比例達(dá)到75.93%（82/108）。臨床上使用排名靠前的抗生素分別是頭孢菌素類[69.52%（57/82）]、酶抑制劑類[50.00%（41/82）]、氟喹諾酮類[37.80%（31/82）]和碳青霉素類[21.95%（18/82）]抗生素。而1個(gè)月之內(nèi)未使用過抗生素的比例為24.07%（26/108），這其中65.38%（17/26）來自消化內(nèi)科，主要見于潰瘍性結(jié)腸炎和慢性結(jié)腸炎患者。

2.3 艱難梭菌毒素基因檢測情況

實(shí)驗(yàn)組108株CD，產(chǎn)毒率為91.67%，而對照組產(chǎn)毒率為75.00%，兩組產(chǎn)毒率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.17）。見表1。

2.4 多位點(diǎn)序列分型和eBURST分析

對108株分離于臨床腹瀉患者的艱難梭菌進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型后，發(fā)現(xiàn)了32種ST型，ST54是相對比較流行的型別，共占了17.59%（19/108），其次是ST3占15.74%（17/108），其余ST型數(shù)量不等。eBURST分析實(shí)驗(yàn)組的108株艱難梭菌和標(biāo)準(zhǔn)庫進(jìn)行比對（截至2018.01.11），發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組32種ST型可以歸為7個(gè)克隆群（CC48、CC11、CC5、CC37、CC99、CC39、CC238）和1個(gè)組（G103）。其中CC48是最大的克隆群，包含了21種ST型，且ST48為CC48的始祖，具有較近的親緣關(guān)系，流行范圍較廣。

3 討論

近20年歐美CD的感染率呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢，特別是核糖體027型菌株的爆發(fā)流行，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[4，10-11]。臨床上，15%～25%的抗生素相關(guān)性腹瀉、50%～70%的抗生素相關(guān)性結(jié)腸炎和幾乎全部的偽膜性腸炎是由CDI引起[5]。徐凱悅[12]收集了2010～2015年河北4家醫(yī)院住院腹瀉患者糞便標(biāo)本1013份，分離到CD 172株，陽性率為16.98%；謝和賓等[13]關(guān)于住院腹瀉患者CD感染率的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，CD整體合并感染率為19%，已經(jīng)高于歐美國家的報(bào)道，亟需引起我們的重視。

本研究中，實(shí)驗(yàn)組患者CD的感染率為12.68%，明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而艱難梭菌陽性的這部分臨床腹瀉患者腹瀉前1個(gè)月至少使用過1種抗生素的比例高達(dá)75.93%，是造成CDI的主要誘因，而余下未用過抗生素的26例CDI患者中，有65.38%的患者患有慢性結(jié)腸炎和/或炎癥性腸病等自身腸道疾病，提示腸道在慢性、反復(fù)、多發(fā)的刺激因素下導(dǎo)致的炎性水腫，潰瘍、出血病變，亦可能是發(fā)生CDI的高危因素。2015年美國艱難梭菌感染臨床實(shí)踐指南中，推薦甲硝唑用于輕到中度病情最初治療，萬古霉素用于重癥或復(fù)雜的CDI[14]。隨著越來愈多的治療失敗或復(fù)發(fā)CDI病例的報(bào)道，傳統(tǒng)抗生素療效受到嚴(yán)重挑戰(zhàn)，新型抗生素非達(dá)霉素、卡達(dá)唑胺和利福昔明等亦表現(xiàn)出較好的臨床療效，另外難治性的CDI患者亦可考慮糞便移植[15]。

CD主要通過分泌毒素致病，毒素A和毒素B是其主要致病因子。毒素A是一種腸毒素，由tcdA基因編碼；毒素B為一種很強(qiáng)的細(xì)胞毒素，由tcdB基因編碼[16]。本研究臨床腹瀉患者108株CD中，產(chǎn)毒率為91.67%，與之前報(bào)道結(jié)果相似[17]，但兩組產(chǎn)毒率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），可能與對照組CD陽性例數(shù)過少有一定關(guān)系。部分CD相關(guān)性腹瀉患者可以只有毒素B的存在，且這種毒素A陰性而毒素B陽性的患者臨床癥狀更重，耐藥性更強(qiáng)，病死率更高。

多位點(diǎn)序列分型常常被用于流行病學(xué)研究，有助于了解菌株間的親緣關(guān)系。本研究采用該分型方法對臨床腹瀉患者108株CD進(jìn)行分析，共檢出32種ST型別，ST54是相對比較流行的型別，分布于多個(gè)臨床科室，其次是ST3和ST2，但ST37數(shù)量較少，不屬于相對流行菌株，與Wang等[18]的研究結(jié)果比較相似，但與Jin等[19]報(bào)道ST37是其主要流行菌株有較大差異，可能存在地域差異，另外也未能檢測到高產(chǎn)毒株核糖體027型（相當(dāng)于ST01）和078型（相當(dāng)于ST11）。

本研究發(fā)現(xiàn)的ST54、ST2、ST26、ST39、ST53均能在兩組中發(fā)現(xiàn)，研究表明ST型與宿主人群的來源沒有明顯的相關(guān)性，同一ST型離散分布在不同的進(jìn)化支中，沒有明顯的聚類現(xiàn)象[20]。eBURST分析發(fā)現(xiàn)CC48是本地區(qū)最大的克隆群，包含了21種ST型，具有較近的親緣關(guān)系，流行范圍較廣，所以及時(shí)關(guān)注臨床CD來源的聚集性，并進(jìn)行有效預(yù)防顯得尤為重要。雖然我國未報(bào)道過聚集性的CD暴發(fā)流行，但高毒力的核糖體027型已在廣州和北京報(bào)道發(fā)現(xiàn)[21-22]，需防范于未然。

綜上所述，臨床腹瀉患者CD的感染率較高，亟需引起臨床重視并加強(qiáng)院感防控，預(yù)防暴發(fā)流行，另外CDI形勢日趨嚴(yán)峻的情況下，合理規(guī)范抗生素的使用和及時(shí)有效的院感防控仍不失為有效的預(yù)防手段，同時(shí)亦需加強(qiáng)CD的臨床認(rèn)知力和實(shí)驗(yàn)室的檢測能力，特別要關(guān)注疾病與CD感染的潛在聯(lián)系，進(jìn)行全方面的監(jiān)測和研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Roshan N，Riley TV，Hammer KA. Effects of natural products on several stages of the spore cycle of Clostridium difficile in vitro [J]. J Appl Microbiol，2018. doi：10.1111/jam.13889.

[2] 倪曉平，徐虹，金慧，等.兩種消毒產(chǎn)品殺滅艱難梭菌芽孢試驗(yàn)與評價(jià)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26（11）：2425-2427.

[3] Alyousef AA. Clostridium difficile：Epidemiology，Pathogenicity，and an Update on Limitations of and Challenges in Its Diagnosis [J]. J AOAC Int，2018，101（4）：1119-1126.

[4] Bagdasarian N，Rao K，Malani PN. Diagnosis and treatment of Clostridium difficile in adults：a systematic review [J]. JAMA，2015，313（4）：398-408.

[5] 中國醫(yī)師協(xié)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)師分會(huì)感染性疾病檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)專家委員會(huì).中國成人艱難梭菌感染診斷和治療專家共識[J].協(xié)和醫(yī)學(xué)雜志，2017，8（2/3）：131-138.

[6] Song Y，Garg S，Girotra M，et al. Microbiota dynamics in patients treated with fecal microbiota transplantation for recurrent Clostridium difficile infection [J]. PLoS One，2014，9（7）：e104471.

[7] Kwon JH，Olsen MA，Dubberke ER. The morbidity，mortality，and costs associated with Clostridium difficile infection [J]. Infect Dis Clin North Am，2015，29（1）：123-124.

[8] Persson S，Torpdahl M，Olsen KE. New multiplex PCR method for the detection of Clostridium difficile toxin A（tcdA）and toxin B（tcd B） and the binary toxin （cdtA/cdtB） genes applied to a Danish strain collection [J]. Clin Microbiol Infect，2008，14（11）：1057-1064.

[9] Griffiths D，F(xiàn)awley W，Kachrimanidou M，et al. Multilocus sequence typing of Clostridium difficile [J]. J Clin Microbiol，2010，48（3）：770-778.

[10] McDonald LC，Gerding DN，Johnson S，et al. Clinical Practice Guidelines for Clostridium difficile infection in Adults and Children：2017 Update by the Infectious Diseases Society of America（IDSA） and Society for Healthcare Epidemiology of America（SHEA）[J]. Clin Infecs Dis，2018，66（7）：e1-e48.

[11] McLure A，Clements ACA，Kirk M，et al. Clostridium difficile classification overestimates hospital-acquired infections [J]. J Hosp Infect，2018，99（4）：453-460.

[12] 徐凱悅.2010～2015年臨床分離艱難梭菌產(chǎn)毒株的分子流行病學(xué)、耐藥狀況以及對利福霉素耐藥機(jī)制研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2016年.

[13] 謝和賓，曾鴻，尹柯，等.我國住院腹瀉患者艱難梭菌感染率的薈萃分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2017，27（5）：961-964.

[14] 賈天野，湯一韋，曲芬.美國艱難梭菌感染臨床診治相關(guān)指南摘要[J].傳染病信息，2015，28（4）：193-196.

[15] Hopkins RJ，Wilson RB. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis：a narrative review [J]. Gastroenterol Rep（Oxf），2018，6（1）：21-28.

[16] Di Bella S，Ascenzi P，Siarakas S，et al. Clostridium difficile Toxins A and B：Insights into Pathogenic Properties and Extraintestinal Effects [J]. Toxins（Basel），2016，8（5）：134.

[17] Chen YB，Gu SL，Wei ZQ，et al. Molecular epidemiology of Clostridium difficile in a tertiary hospital of china [J]. J Med Microbiol，2014，63（Pt 4）：562-569.

[18] Wang R，Suo L，Chen HX，et al. Molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility of Clostridium difficile isolated from the Chinese People′s Liberation Army General Hospital in China [J]. Int J Infect Dis，2017，67：86-91.

[19] Jin D，Luo Y，Huang C，et al. Molecular Epidemiology of Clostridium difficile Infection in hospitalized Patients in Eastern China [J]. J Clin Microbiol，2017，55（3）：801-810.

[20] 陳麗丹.不同來源的艱難梭菌其毒素、MLST分型及藥敏情況的分析[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2016.

[21] Wang P，Zhou Y，Wang Z，et al. Identification of Clostridium difficile ribotype 027 for the first time in Mainland China [J]. Infect Control Hosp Epidemiol，2014，35（1）：95-98.

[22] Cheng JW，Xiao M，Kudinha T，et al. The first two Clostridium difficile ribotype 027/ST1 isolates identified in Beijing，China-an emerging problem or a neglected threat？[J].Sci Rep，2016，6：18834.

（收稿日期：2018-07-24 本文編輯：封 華）