外泌體功能與臨床應用研究進展

魏曉晶 胡曉

[摘要] 外泌體是由細胞分泌的膜性囊泡，是細胞間通訊的重要介質(zhì)，參與到細胞間生物信號的傳遞。目前有5種公認且較為常用的提取外泌體的方法。外泌體在臨床疾病研究中突破性的進展主要體現(xiàn)在外泌體參與腫瘤疾病的進展、外泌體中的核酸或蛋白可以作為疾病的分子標志物、外泌體可以作為藥物的載體進行靶向治療等方面。外泌體在疾病中行使的功能使其極具向臨床應用的優(yōu)勢。本文主要從外泌體的發(fā)現(xiàn)、提取方法優(yōu)缺點及其在臨床疾病功能的研究進展這三個方面加以闡述。

[關鍵詞] 外泌體；提取方法；外泌體與臨床疾病

[中圖分類號] R733 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（a）-0045-04

1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)[1-2]，1987年Johnstone等[3]將其命名為“exosome”。研究者最初認為外泌體是一種實驗的人工制品、廢物或死細胞的殘留物[1]。到20世紀90年代，Zitvogel等[4]和Raposo等[5]發(fā)現(xiàn)外泌體很可能是細胞間相互交流的一種新方式。2007年，Valadi等[6]發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)攜帶有核酸（mRNA、microRNA等）和蛋白質(zhì)，并可以被其他細胞捕獲。這一系列的突破性發(fā)現(xiàn)打開了外泌體研究的新篇章。目前，外泌體提取方法各具特色，并能夠得到用于研究的外泌體，因此外泌體研究在近幾年呈現(xiàn)指數(shù)型上漲。外泌體在臨床疾病方面也有較多突破性的報道，這種納米級的小分子有希望替代細胞治療投入到臨床應用之中。

1 外泌體定義與提取鑒定方法

外泌體是攜帶核酸和蛋白質(zhì)的直徑為30～150 nm的膜性囊泡，外泌體表面表達CD63、CD9、CD81等表面標志物。胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）為細胞分泌的由膜包裹的囊泡統(tǒng)稱為胞外囊泡，其包括外泌體、外膜泡、微泡、微粒、凋亡小體和其他EV亞群。外泌體起源于質(zhì)膜循環(huán)途徑中的膜腔或早期胞內(nèi)體，這些膜腔或早期胞內(nèi)體向內(nèi)凹陷形成管腔內(nèi)膜泡，進一步發(fā)展成為多泡小體，多泡小體在細胞內(nèi)分子馬達的牽引下與細胞表面融合，最終分泌出去[7]?；谕饷隗w的物理化學和生物化學性質(zhì)，已經(jīng)開發(fā)了許多用于分離外泌體的技術。

1.1 外泌體提取方法

外泌體提取方法可分為5類，分別是超速離心、超濾、免疫吸附、沉淀法、基于微流控的分離技術等[8-9]。這5種提取外泌體的方法所依據(jù)的原理以及其各自的優(yōu)缺點，見表1。

1.2 外泌體的鑒定

國際細胞外囊泡學會（ISEV）[10]于2014年發(fā)布了研究和定義細胞外囊泡及其功能所需要的最少實驗要求的指導性聲明文件。文中指出：對于外泌體的鑒定必須從形態(tài)、蛋白分子標記、粒徑大小等三個方面進行鑒定。

使用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)特征和大小，在電鏡下呈現(xiàn)為杯子樣的形態(tài)。條件培養(yǎng)基經(jīng)過高速離心得到的外泌體直徑在30～150 nm[11]。動態(tài)粒子跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）的方法可檢測顆粒的直徑大小和納米粒子的濃度[12-13]，它通過記錄在布朗運動下激光照射的單個粒子的運動，然后用統(tǒng)計學的方法計算顆粒直徑。外泌體攜帶有許多不同的蛋白標記，如HSP70和CD81、CD9、CD63等[14]，因此可以使用磁珠增加外泌體的體積從而用流式分析檢測其表面標志物，同樣可以使用Western blot檢測外泌體含有的蛋白標記[15]。國際細胞外囊泡學會規(guī)定了最少需要檢測的外泌體蛋白標記，包括外泌體內(nèi)（TSG101等）和外泌體表面蛋白（CD63等）。

2 外泌體功能研究進展

基于外泌體參與細胞間交流的功能，外泌體內(nèi)攜帶的核酸/蛋白可以參與疾病的進展，可以作為疾病診斷的分子標記，同樣也可作為藥物載體靶向特定疾病部位。

2.1 參與細胞與細胞間的交流

外泌體作為細胞間信息交流的載體，將其所攜帶的核酸和蛋白傳遞到受體細胞內(nèi)并影響受體細胞的功能。在生理條件下，細胞通過分泌外泌體介導細胞間信息的傳遞，間充質(zhì)干細胞的外泌體和微泡以劑量依賴性方式抑制T淋巴細胞增殖并降低CD4+和CD8+T細胞亞群的比例，外泌體增加了Treg細胞群的數(shù)量[16]。樹突細胞分泌的外泌體能夠募集間充質(zhì)干細胞，提高間充質(zhì)干細胞向損傷部位的遷移能力，從而促進損傷局部的修復[17-18]。在病理條件下，腫瘤細胞分泌的外泌體通過與骨髓內(nèi)造血祖細胞的相互作用，或者是腫瘤細胞直接與淋巴結相互作用，又或者是通過與周圍成纖維細胞的相互作用，從而增加腫瘤細胞的遷移能力。Luga等[19]報道成纖維細胞分泌的外泌體通過Wnt-PCP信號通路促進乳腺癌細胞（BCC）的侵襲性行為，揭示了腫瘤細胞通過外泌體拉攏正常細胞促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移方式。在缺氧的條件下，HIF-1α迅速累積并反式激活基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）表達[20]，缺氧誘導外泌體裝載MMP-13改變微環(huán)境從而增強鼻咽癌細胞的遷移能力和侵襲性。Rutgers Biomedical and Health Sciences （RBHS）的研究人員發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞會使間充質(zhì)干細胞釋放含有不同的miRNA（如miR-222/223）的外泌體，從而促進一部分癌細胞處于靜止期，并獲得抗藥性[21]。

2.2 作為疾病的分子標志物

外泌體內(nèi)攜帶有癌細胞的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等信息，因此外泌體可以作為癌癥的診斷工具。在對胰腺癌患者的研究中，Melo等[22]發(fā)現(xiàn)細胞表面蛋白多糖磷脂酰肌醇聚糖-1（glypican-1，GPC1）在胰腺癌患者血液外泌體中含量豐富，患者血清外泌體中GPC1能夠以100%的準確率和敏感性診斷出早期胰腺癌。通過對急性中風性患者及正常人進行對比分析發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-9和miR-124的水平有希望作為生物標志物用于急性缺血性中風患者的診斷和缺血性損傷程度的評估[23]。DNM3、p65和p53在原始和復發(fā)性多形性膠質(zhì)母細胞瘤患者的腦和血液外泌體中都有類似的改變趨勢，可以作為多形性膠質(zhì)母細胞瘤的潛在臨床診斷標記[24]。多發(fā)性骨髓瘤患者血清外泌體中攜帶的miRNA中的兩個，即let-7b和miR-18a，在單變量分析中與無進展生存期和總生存期顯著相關，因此let-7b和miR-18a可以作為多發(fā)性骨髓瘤疾病的分子標志物[25]。以外泌體為基礎的診斷使得在癌癥病情發(fā)展過程中可及時監(jiān)測分子標志物的變化，這種基于血液樣本的檢測比重復的組織活檢更容易收集樣本，更易監(jiān)控疾病的進展。

2.3 作為藥物傳輸?shù)妮d體

外泌體表面表達各種粘連蛋白（跨膜蛋白和整合素）能夠促進膜的相互作用和膜融合。用PEG-AA載體修飾裝載有紫杉醇的外泌體[26]，將改善藥物在血液中的循環(huán)時間并能夠靶向肺轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞。Dong等[27]發(fā)現(xiàn)來自正常人的血清和肌管細胞的外泌體能夠攜帶（dysferlin，DYSF）蛋白到達DYSF敲除的小鼠細胞中，為蛋白缺陷或缺失造成的病癥提供了新的治療策略。利用間充質(zhì)干細胞的歸巢能力，同時工程化修飾細胞分泌富含miR-379的胞外囊泡，作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌的創(chuàng)新療法[28]。細胞外囊泡被嵌入到植入式生物材料中[29]，旨在利用酶前體藥物療法實現(xiàn)局部治療的藥物遞送。基于RNA的療法，將抗體樣（即Y形狀）RNA納米顆粒附著到微泡上可以有效地將RNA治療劑特異性地遞送給癌細胞[30]。外泌體作為具有生物活性的在細胞間進行物質(zhì)傳遞的系統(tǒng)，具有成為治療藥物載體的巨大潛力。

3 展望

在正常生理過程中外泌體發(fā)揮著介導細胞間通訊的重要功能[31]，它們也能夠調(diào)節(jié)宿主-病原體的相互作用[32]，參與傳染性疾病、炎性疾病、神經(jīng)疾病和癌癥等多種疾病的病理過程，可作為干預及治療的潛在新靶點。隨著對外泌體研究的深入，外泌體在臨床醫(yī)學中有十分光明的應用前景，主要是因為它們攜帶有核酸和蛋白，有豐富的生物標志物，可用于監(jiān)測臨床狀態(tài)、疾病進展、治療反應等。同時由于它們具有遞送生物分子的功能，可作為理想的藥物傳遞載體，通過將分子包裹在胞膜內(nèi)，可以保護酶或者RNA免于降解，并通過細胞內(nèi)吞作用來促進細胞攝取。在再生醫(yī)學應用方面，與干細胞相比，外泌體體積更小，復雜性更低，易于生產(chǎn)和存儲，甚至更容易避免干細胞研究應用面臨的一些監(jiān)管問題，同時干細胞外泌體不存在形成腫瘤的風險。此外，由于膜結合蛋白含量較低，外泌體的免疫原性低于干細胞。相信在不遠的將來，基于外泌體本身的生理及病理功能可將外泌體應用于疾病的診斷與治療，為患者帶來福音。目前，外泌體的功能還沒有完全闡明，外泌體內(nèi)攜帶的蛋白與核酸具有不確定性，外泌體與受體細胞的相互作用方式仍然不明確，這一系列問題都有待于科研人員的進一步探索。

[參考文獻]

[1] Pan BT，Johnstone RM. Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro：selective externalization of the receptor [J]. Cell，1983，33（3）：967-978.

[2] Harding C，Heuser J，Stahl P. Receptor-mediated Endocytosis of Transferrin and recycling of the Transferrin Receptor in Rat Reticulocytes [J]. J Cell Biol，1983，97（2）：329-339.

[3] Johnstone RM，Adam M，Hammond JR. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles（exosomes）[J]. J Biol Chem，1987，262（19）：9412-9420.

[4] Zitvogel L，Lozier A，Lozier A，et al. Eradication of established nurine tumors using a novel cell-free vacine：dendritic-cell derived exosomes [J]. Nat Med，1998，4（5）：594-600.

[5] Raposo G，Nijman HW，Stoorvogel W，et al. B lymphocytes Secrete Antigen-presenting vesicles [J]. J Exp Med，1996， 183（3）：1161-1172.

[6] Valadi H，Ekstrom K，Bossios A，et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells [J]. Nat Cell Biol，2007， 9（6）：654-659.

[7] Raposo G，Stoorvogel W. Extracellular vesicles：exosomes，microvesicles，and friends [J]. J Cell Biol，2013，200（4）：373-383.

[8] Shao H，Im H，Castro CM，et al. New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles [J]. Chem Rev，2018， 118（4）：1917-1950.

[9] Li P，Kaslan M，Lee SH，et al. Progress in Exosome Isolation Techniques [J]. Theranostics，2017，7（3）：789-804.

[10] Lotvall J，Hill AF，Hochberg F，et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions：a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles [J]. J Extracell Vesicles，2014，3：26913.

[11] Colombo M，Moita C，van Niel G，et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis，composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles [J]. J Cell Sci，2013，126（Pt 24）：5553-5565.

[12] Dragovic RA，Gardiner C，Brooks AS，et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis [J]. Nanomedicine，2011，7（6）：780-788.

[13] Gardiner C，F(xiàn)erreira YJ，Dragovic RA，et al. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis [J]. J Extracell Vesicles，2013，2.

[14] Baietti MF，Zhang Z，Mortier E，et al. Syndecan-syntenin-ALIX regulates the biogenesis of exosomes [J]. Nat Cell Biol，2012，14（7）：677-685.

[15] Théry C，Amigorena S，Raposo G，et al. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids [J]. Curr Protoc Cell Biol，2006.

[16] Cosenza S，Toupet K，Maumus M，et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes are more immunosuppressive than microparticles in inflammatory arthritis [J]. Theranostics，2018，8（5）：1399-1410.

[17] Silva AM，Almeida MI，Teixeira JH，et al. Dendritic Cell-derived Extracellular Vesicles mediate Mesenchymal Stem/Stromal Cell recruitment [J]. Sci Rep，2017，7（1）：1667.

[18] Siravegna G，Marsoni S，Siena S，et al. Integrating liquid biopsies into the management of cancer [J]. Nat Rev Clin Oncol，2017，14（9）：531-548.

[19] Luga V，Zhang L，Viloria-Petit AM，et al. Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration [J]. Cell，2012，151（7）：1542-1556.

[20] Shan Y，You B，Shi S，et al. Hypoxia-Induced Matrix Metalloproteinase-13 Expression in Exosomes from Nasopharyngeal Carcinoma Enhances Metastases [J]. Cell Death Dis，2018，9（3）：382.

[21] Bliss SA，Sinha G，Sandiford OA，et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Stimulate Cycling Quiescence and Early Breast Cancer Dormancy in Bone Marrow [J]. Cancer Res，2016，76（19）：5832-5844.

[22] Melo SA，Luecke LB，Kahlert C，et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer [J]. Nature，2015，523（7559）：177-182.

[23] Ji Q，Ji Y，Peng J，et al. Increased Brain-Specific MiR-9 and MiR-124 in the Serum Exosomes of Acute Ischemic Stroke Patients [J]. PLoS One，2016，11（9）：e0163645.

[24] Yang JK，Song J，Huo HR，et al. DNM3，p65 and p53 from exosomes represent potential clinical diagnosis markers for glioblastoma multiforme [J]. Ther Adv Med Oncol，2017，9（12）：741-754.

[25] Manier S，Liu CJ，Avet-Loiseau H，et al. Prognostic role of circulating exosomal miRNAs in multiple myeloma [J]. Blood，2017，129（17）：2429-2436.

[26] Kim MS，Haney MJ，Zhao Y，et al. Engineering macrophage-derived exosomes for targeted paclitaxel delivery to pulmonary metastases：in vitro and in vivo evaluations [J]. Nanomedicine，2018，14（1）：195-204.

[27] Dong X，Gao X，Dai Y，et al. Serum exosomes can restore cellular function in vitro and be used for diagnosis in dysferlinopathy [J]. Theranostics，2018，8（5）：1243-1255.

[28] O′brien KP，Khan S，Gilligan KE，et al. Employing mesenchymal stem cells to support tumor-targeted delivery of extracellular vesicle （EV）-encapsulated microRNA-379 [J]. Oncogene，2018，37（16）：2137-2149.

[29] Fuhrmann G，Chandrawati R，Parmar PA，et al. Engineering Extracellular Vesicles with the Tools of Enzyme Prodrug Therapy [J]. Adv Mater，2018，30（15）：e1706616.

[30] Pi F，Binzel DW，Lee TJ，et al. Nanoparticle orientation to control RNA loading and ligand display on extracellular vesicles for cancer regression [J]. Nat Nanotechnol，2018，13（1）：82-89.

[31] van Niel G，D′Angelo G，Raposo G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2018，19（4）：213-228.

[32] Zhang W，Jiang X，Bao J，et al. Exosomes in Pathogen Infections：A Bridge to Deliver Molecules and Link Functions [J]. Front Immunol，2018，9：90.

（收稿日期：2018-04-28 本文編輯：封 華）