紫靈芝培養(yǎng)條件優(yōu)化實驗

◎ 楊秀芬，陳澤宇

（1.保定圣德益眾生物科技有限公司，河北 保定 071000；2.衡水市第二中學，河北 衡水 053000）

目前，多使用靈芝的子實體和靈芝孢子粉入藥，發(fā)酵生產靈芝菌絲體，發(fā)酵時間長，獲得菌絲體生物量不高，生產成本高，發(fā)酵難度大。本研究通過對紫芝單因子搖瓶試驗獲得最佳培養(yǎng)參數，研究獲得菌絲體的方法，從而為進一步深入研究靈芝菌絲體的藥理作用和工業(yè)化生產途徑做好前期研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紫靈芝[Ganoderma japonicum(Fries) Lloyd]，河北大學提供。

1.2 實驗儀器

L3S型可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）、ZWY-2112D型旋轉式搖床（上海智誠分析儀器制造有限公司）、BSC-250型培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、PHS-3C型pH計（上海優(yōu)科儀器儀表有限公司）。

1.3 實驗試劑

蔗糖、葡萄糖（天津市福晨化學試劑廠）、蛋白胨（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠）、MgSO4·7H2O（天津市光晨科技發(fā)展公司）、KH2PO4（天津市科密歐化學試劑公司）、VB1（大同市云岡制藥廠）。

基礎培養(yǎng)基：玉米粉2%，蔗糖2%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.005%。

1.4 實驗設計

紫芝菌種經過3次轉接活化后，分別對影響紫芝發(fā)酵的pH值、裝液量、接種量、培養(yǎng)時間、發(fā)酵溫度和搖床轉速等因素，進行單因子試驗。以菌絲體干重和多糖含量為指標，篩選出最佳培養(yǎng)條件[1]。

1.5 計算方法

（1）菌絲干質量測定方法。取發(fā)酵液100 mL用80目的銅網過濾得菌絲體，用蒸餾水洗滌3次，置于65 ℃恒溫干燥箱中烘干，稱量其干重，計算公式為：

菌絲干質量（mg·mL-1）=菌絲體干質量（mg）÷發(fā)酵液體積（mL）。

（2）胞外多糖測定方法。采用濃硫酸-苯酚法測定。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵最適pH的篩選

調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，接種量均為8%，裝液量為 150 mL，搖床培養(yǎng)（150 r·min-1，26 ℃）6 d后，收集菌絲，測定菌絲干質量、胞外多糖產量，見表1。

表1 pH不同所得發(fā)酵液多糖和菌絲干質量含量表

由表1可以看出，pH為6.5較合適。

2.2 最適裝液量篩選

在500 mL的三角瓶中分別裝不同量發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為 8%，pH 6.5，搖床（150 r·min-1，29 ℃）培養(yǎng)5 d，測定生物量、菌絲多糖產量，結果見表2。

表2 裝液量不同所得發(fā)酵液多糖和菌絲干質量含量表

由表2得出，當裝液量為150 mL時，生物量和胞外多糖含量都接近最高值。

2.3 最適接種量篩選

在500 mL三角瓶中裝150 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 6.5，調節(jié)接種量，搖床（180 r·min-1，29 ℃）培養(yǎng)5 d，測定生物量、菌絲多糖產量，結果見表3。

表3 接種量不同所得發(fā)酵液多糖和菌絲干質量含量表

由表3得出，菌絲生物量在接種量為10%時最高。

2.4 最適培養(yǎng)時間篩選

在500 mL三角瓶中裝150 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 6.5，接種量10%，搖床（150 r·min-1，29 ℃）培養(yǎng)不同天數，測定生物量、胞外多糖產量[2]，結果見表4。

表4 培養(yǎng)時間不同所得發(fā)酵液多糖和菌絲干質量含量表

結果得出，菌絲生物量在第5 d產量最高，菌絲生物量最高。

2.5 最適發(fā)酵溫度篩選

在500 mL三角瓶中裝150 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 6.5，接種量10%，搖床轉速180 r·min-1，在不同溫度下培養(yǎng)5 d，測定生物量，胞外多糖產量，結果見表5。

表5 發(fā)酵溫度不同所得發(fā)酵液多糖和菌絲干質量含量表

由表5得出，當溫度為29 ℃時，菌絲的生物量和多糖產量都達到最高。

2.6 最適搖床轉速篩選

在500 mL三角瓶中裝150 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，pH為6.5，接種量分別為10%，在29 ℃條件下實驗，培養(yǎng)時間為5 d，測定生物量、胞外多糖產量，結果見表6[3]。

表6 轉速不同所得發(fā)酵液多糖和菌絲干質量含量表

由表6得出，轉速在180 r·min-1時，菌絲的生物量和多糖產量最高。

3 結論

經過實驗優(yōu)化，得出了最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件：最佳發(fā)酵條件起始pH為6.5，裝液量150 mL，接種量10%，最佳發(fā)酵時間為5 d，最佳發(fā)酵溫度29 ℃，最佳搖床轉速在 160 r·min-1。