基于不同熒光納米粒子的免疫層析技術(shù)及其在食品安全檢測中的應(yīng)用

◎ 吳民富，李 莎，蔡津津，林柔珍，崔寶儀，廖杰靈，梁祖培

（1．佛山職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)系，廣東 佛山 528137；2．廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東 佛山 528300）

Wu Minfu1， Li Sha1， Cai Jinjin1， Lin Rouzhen1， Cui Baoyi1， Liao Jieling1， Liang Zupei2

（1.Department of Food Science， Foshan Vocational and Technical College， Foshan 528137， China；2.Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision， Foshan 528300， China)

免疫層析檢測試紙條（Immunochromatographic test strips，ICTSs）技術(shù)從20世紀(jì)90年代開始迅速發(fā)展，是一種快速、簡便的分析技術(shù)。ICTSs把層析技術(shù)的便捷性和免疫反應(yīng)的快捷、高靈敏等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，具有簡單、快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1]。目前，用于ICTSs中的標(biāo)記納米探針多來越多，如膠體金、熒光納米材料、磁性納米材料、復(fù)合納米材料等，其中以膠體金探針報(bào)道的最多[2]。但免疫層析試紙存在的缺點(diǎn)就是難以達(dá)到檢測限標(biāo)準(zhǔn)。目前可從兩方面解決此問題：①采用定量檢測，當(dāng)前已經(jīng)大量報(bào)道。②采用新型標(biāo)記材料，如采用熒光納米材料來提高試紙條檢測的靈敏度。

1 免疫層析分析技術(shù)

免疫層析技術(shù)將免疫分析技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合，在環(huán)境分析、臨床診斷、食品安全檢測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。其原理是通過對(duì)抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，采用雙抗體夾心法或競爭法對(duì)待測物進(jìn)行檢測。雙抗體夾心檢測法利用捕獲抗體和檢測抗體對(duì)待測物進(jìn)行分析，一般用于檢測分子量較大的抗原或抗體，因?yàn)樯锎蠓肿映：袃蓚€(gè)或以上的抗原決定簇（Antigenic determinant）。競爭法常用于小分子物質(zhì)的檢測，小分子物質(zhì)通常只有一個(gè)抗原決定簇，常采用競爭免疫試驗(yàn)進(jìn)行檢測。競爭法又分為直接競爭法和間接競爭法兩種。

2 免疫層析技術(shù)中常用的熒光納米材料及其在食品安全分析中的應(yīng)用

2.1 熒光納米材料

納米材料是尺寸在1～100 nm范圍內(nèi)的材料的統(tǒng)稱，具有體積效應(yīng)、表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)等。而熒光納米粒子由于其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢測中。與其他傳統(tǒng)的熒光材料相比，熒光納米材料熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好，不易被光漂白；熒光納米材料斯托克斯位移大，發(fā)射波長窄且對(duì)稱。一些特殊的熒光納米材料，能夠通過控制尺寸的大小來改變發(fā)射波長，從而實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記的同步分析?，F(xiàn)在越來越多的報(bào)道將熒光納米材料與儀器的定量檢測結(jié)合在一起，來提高免疫層析試紙條技術(shù)的靈敏度，使得免疫層析技術(shù)在快捷簡便、能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場篩選的同時(shí)，也能夠達(dá)到檢測限的需要。

2.2 常用的熒光材料在免疫層析技術(shù)中的應(yīng)用

2.2.1 量子點(diǎn)

量子點(diǎn)主要由Ⅱ～Ⅳ族、Ⅲ～Ⅴ族元素組成，是一類半導(dǎo)體熒光納米材料。量子點(diǎn)具有比表面積大、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)[3]，且具有激發(fā)波長范圍較寬，斯托克斯位移大等優(yōu)良的光化學(xué)性質(zhì)。故可采用同一激發(fā)光激發(fā)不同粒徑量子點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)檢測，實(shí)現(xiàn)多殘留分析。Taranova等[4]采用不同粒徑的量子點(diǎn)對(duì)食品中3種抗生素開展免疫層析檢測，檢測限比傳統(tǒng)的ELISA方法高80～200倍，大大降低了檢測閾值。量子點(diǎn)熒光材料的發(fā)射波長可以根據(jù)改變量子點(diǎn)的大小和組成來改變，且可跨域紫外到紅外區(qū)間[5]。

量子點(diǎn)具有的熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好、熒光壽命長、生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)，使其在免疫層析技術(shù)中的應(yīng)用越來越廣泛。張蕾等[6]通過水相法合成CdTe量子點(diǎn)熒光材料，采用EDC法偶聯(lián)抗體檢測蝦肉中的呋喃唑酮，檢測限達(dá)到10 mg·mL-1。有研究人員采用微乳膠技術(shù)將量子點(diǎn)包裹，以解決量子點(diǎn)聚沉的問題，通過信號(hào)放大提高檢測的靈敏度。Ren等[7]采用微乳技術(shù)將CdSe/ZnS量子點(diǎn)包裹成表面帶羧基的微球，建立免疫分析方法對(duì)玉米中黃曲霉毒素檢測半抑制濃度（IC50）為 13.87 pg·mL-1，檢測限達(dá) 0.42 pg·mL-1，比單獨(dú)使用量子點(diǎn)、標(biāo)記的試紙條的靈敏度提升39倍，可用于食品安全現(xiàn)場快速檢測。Duan等[8]采用量子點(diǎn)微球免疫層析法檢測玉米提取物中的玉米烯酮毒素，檢測限為3.6 μg·kg-1。有研究者將待檢測物標(biāo)記量子點(diǎn)，抗體包被在檢測線上來設(shè)計(jì)競爭反應(yīng)。

量子點(diǎn)免疫層析分析方法簡單、快速、靈敏度高，適合食品安全現(xiàn)場篩查。定量檢測的量子點(diǎn)試紙條靈敏度比膠體金免疫層析試紙條要高，逐漸成為免疫層析分析技術(shù)研究的熱點(diǎn)。

2.2.2 稀土材料

稀土材料是由鑭系稀土元素或者其摻雜于惰性材料組成的納米晶體粒子[9]。根據(jù)斯托可斯位移的不同，稀土納米材料分為上轉(zhuǎn)換和下轉(zhuǎn)換熒光材料。上轉(zhuǎn)換熒光材料信號(hào)比較穩(wěn)定，不容易受環(huán)境和背景干擾的影響，因此可有效提高檢測靈敏度。Wu等[10]利用上轉(zhuǎn)換熒光粒子同時(shí)檢測金黃色葡萄球菌等3種食源性致病菌。下轉(zhuǎn)換熒光材料具有超長的發(fā)射光半衰期，經(jīng)延長測量時(shí)間，可消除背景熒光提高檢測的靈敏度。李靜等[11]結(jié)合時(shí)間分辨熒光技術(shù)與免疫層析技術(shù)，對(duì)油料餅粕中的黃曲霉毒素B1進(jìn)行檢測?；厥章试?0%～120%，且對(duì)單個(gè)樣品檢測時(shí)間低于15 min可應(yīng)用于大批量油料餅粕的分析檢驗(yàn)。丁小霞等[12]采用Eu3+硅膠熒光微粒建立黃曲霉毒素B1時(shí)間分辨熒光免疫層析法，比膠體金免疫層析法的靈敏度提高1個(gè)數(shù)量級(jí)以上。該方法對(duì)花生、植物油等農(nóng)產(chǎn)品的檢出限為0.3 μg·kg-1。

2.2.3 高分子熒光納米微球

高分子熒光納米微球是負(fù)載有機(jī)熒光染料分子的無機(jī)納米顆?；蚨嗑凵锎蠓肿影患{米顆粒[13]，以聚苯乙烯、聚丙烯酰胺類等為主體。納米微球?qū)杀Ｗo(hù)鎖包裹的熒光染料，避免環(huán)境對(duì)材料的影響。納米顆粒內(nèi)部包裹的熒光數(shù)量較多，可放大檢測信號(hào)，提高檢測靈敏度。Liu等[14]采用熒光微球探針建立免疫分析方法，對(duì)醬油中黃曲霉毒素B1進(jìn)行檢測，檢出限達(dá)到2.5 μg·L-1。Zang等[15]建立基于熒光微球的免疫層析技術(shù)對(duì)玉米中的黃曲霉毒素B1進(jìn)行定量檢測，回收率在91%～118%。

2.2.4 復(fù)合熒光納米粒子

復(fù)合熒光納米材料采用多種納米材料進(jìn)行復(fù)合，使得復(fù)合物具有每種單一材料的優(yōu)點(diǎn)。常見的二氧化硅納米復(fù)合材料由功能化的內(nèi)核、可進(jìn)行生物功能化的硅外殼以及表面生物分子構(gòu)成。該類納米顆粒內(nèi)核常采用油包水（W/O）反相微乳液方法合成，通過硅烷化試劑進(jìn)行包殼，通過生物功能化對(duì)納米顆粒的表面進(jìn)行生物分子修飾。復(fù)合熒光二氧化硅納米粒子具有良好的分散性，合成條件較為溫和，在食品安全檢測領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。Song等[16]采用SiO2包裹Eu(Ⅲ)–BHHCT制備SiO2熒光納米復(fù)合材料，建立免疫層析法對(duì)β-興奮劑進(jìn)行檢測，肉眼觀察法LOD為 0.1 ng·mL-1，儀器檢測法 LOD 為 0.037 ng·mL-1，檢測限遠(yuǎn)低于膠體金免疫層析試紙條。不同熒光納米粒子在食品安全檢測中的應(yīng)用見表1。

表1 不同熒光納米粒子在食品安全檢測中的應(yīng)用表

3 結(jié)論展望

免疫層析分析技術(shù)近年來發(fā)展迅速，主要的發(fā)展方向有：①通過信號(hào)放大結(jié)合檢測儀器可提高檢測的靈敏度。采用納米磁分離技術(shù)、生物素-親和素技術(shù)或采用新型生物分子標(biāo)記物。②實(shí)現(xiàn)半定量和定量檢測。定性檢測的結(jié)果通常靈敏度較低，難以滿足檢測的要求，因此可通過采用檢測靈敏度更高的標(biāo)記物或通過確定檢測帶的顯色時(shí)間對(duì)待測物進(jìn)行定量。③實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多種分析物的檢測，可采用熒光微球或鑭系元素同時(shí)檢測多種物質(zhì)。多標(biāo)記測定技術(shù)可節(jié)省前處理時(shí)間和步驟，檢測速度，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。