液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中氯霉素殘留量的不確定度

◎ 陳梅斯，練習中，鄭麗斯

（江門市食品檢驗所，廣東 江門 529000）

1 實驗部分

1.1 主要儀器設(shè)備與試劑

1.1.1 儀器設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（API4000，美國AB公司）、液相色譜柱（Shim-pack XR-ODS 3.0 mm×75 mm，2.2 μm)、振蕩器（上海南匯橫沔廠）、固相萃取裝置（AB-1110，美國Abel）、電子天平（JJ-2000B，常熟市雙杰測試儀器廠）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）、水浴氮吹儀（WD-12，杭州奧盛儀器有限公司）。

1.1.2 試劑

氯霉素標準品、氯霉素-D5標準品，無水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純，乙酸乙酯、甲醇為色譜純。

1.2 測試方法

按照SN/T 1864-2007《進出口動物源食品中氯霉素殘留量的檢測方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的規(guī)定，本法使用內(nèi)標法對樣品中氯霉素殘留量進行定量。實驗操作方法如下：稱取5.00 g蜂蜜試樣置于50 mL具塞離心管中，準確加入0.1 mL氯霉素-D5（10 ng·mL-1）內(nèi)標溶液，加15 mL 15%氯化鈉水溶液，加25 mL乙酸乙酯后振蕩提取1 min，離心取上層乙酸乙酯提取液過無水硫酸鈉柱，收集于濃縮瓶中，樣品殘渣中再加入20 mL乙酸乙酯重復上述操作，合并乙酸乙酯提取液在50 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，用4 mL水溶解濃縮物后過C18固相萃取柱凈化，再用10 mL水分兩次洗滌濃縮瓶，洗滌液均過固相萃取柱，經(jīng)淋洗后，最后用6 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮吹儀濃縮近干后加10 mL50%甲醇水溶液溶解，過濾膜后上機測定。

2 不確定度的評定

2.1 數(shù)學模型

樣品中的氯霉素殘留含量按式（1）計算：

式（1）中：X-樣品中氯霉素的殘留量，單位為μg·kg-1；c-從標準曲線上得到的氯霉素溶液濃度，單位為ng·mL-1；V-樣液最終定容體積，單位為mL；m-最終樣液代表的試樣的質(zhì)量，單位為g。

2.2 不確定度的來源

①本法使用內(nèi)標法進行定量，從標準曲線上得到的溶液濃度引入的不確定度主要來自以下4個方面：氯毒素和內(nèi)標峰面積之比的不確定度、標準曲線斜率a及截距b的不確定度、內(nèi)標工作液濃度cis的不確定度以及加入樣品中內(nèi)標工作液體積Vis的不確定度。因以上不確定度主要來源于實驗過程中人員操作、試劑、損失因子等變動性較大的因素，很難精確評估，因此采用A類方法評定為主，B類評定為輔。②最終定容的體積及溫度對體積的影響引入的相對不確定度，采用B類方法評定。③稱量樣品時天平引入的相對不確定度，采用B類方法評定。

2.3 不確定度分量的評定

2.3.1 從標準曲線上得到的氯霉素溶液濃度的相對不確定度u(c)

2.3.1.1 氯霉素和內(nèi)標峰面積之比的不確定度u(y)樣液中氯霉素和內(nèi)標峰面積之比可以通過實驗直接讀取，與線性回歸無關(guān)，其不確定度來源于方法精密度，人員操作、污染因子等所導致的峰面積之比的變動性，因此采用A類評定。根據(jù)實驗方法測定n個平行樣品，得到n個儀器響應(yīng)值。對這n次平行實驗結(jié)果進行統(tǒng)計運算，其標準偏差s(y)作為不確定度u(y)。本實驗在相同條件下，連續(xù)測定10個樣品，10次測定峰面積比的平均值A(chǔ)=0.448，根據(jù)公式計算得氯霉素和內(nèi)標峰面積之比的不確定度u(y)：

2.3.1.2 斜率a及截距b的標準不確定度u(a)、u(b)

上述的數(shù)學模型是在假設(shè)回歸方程為y=ax+b的前提下建立的。斜率和截距的不確定度主要包括由每個實驗點的不確定度和實驗點相對最佳擬合直線的分散性所引起的不確定度。按照標準配制氯霉素濃度為0.05、0.1、0.4、0.8 ng·mL-1和 1.2 ng·mL-1，內(nèi)標濃度為0.1 ng·mL-1的標準溶液，對5個標準點平行測定3次：由標準點的測定數(shù)值計算可得擬合方程為y=0.611 2x+0.002 2（r=0.999 9）。

按式

計算得s(y)=0.00162

公式中：yji-儀器上所得氯霉素與內(nèi)標峰面積之比，yi-對應(yīng)濃度的回歸方和計算值，m-標準點的數(shù)目，n-重復測定的次數(shù)。

2.3.1.3 內(nèi)標工作液濃度cis的不確定度u(cis)

由于內(nèi)標是100 μg·mL-1濃度的D5氯霉素儲備液，因此內(nèi)標工作液的不確定度由兩部分構(gòu)成，內(nèi)標定值引入的不確定度和由內(nèi)標儲備液配制工作液引入的不確定度。

（1）內(nèi)標定值引入的相對標準不確定度u(is)。證書給定的定值最大允差為±1%，按照均勻分布，

（2）配制內(nèi)標工作液引入的相對標準不確定度u(is)2。內(nèi)標工作液按如下步驟配制：移取1.00 mL內(nèi)標儲備液至50 mL容量瓶，定容后配成20 μg·mL-1內(nèi)標中間液，然后再移取0.25 mL內(nèi)標中間液定容至50 mL配成10 ng·mL-1內(nèi)標工作液。

①由1.00 mL移液管引入的相對標準不確定度u(1.00)

A級1.00 mL單標移液管允差為±0.005 mL，按均勻分布，

②由50 mL容量瓶引入的相對標準不確定度u(50)

50 mL A級單標線容量瓶的最大容量允差為±0.05 mL，按均勻分布，

由容量瓶校準溫度與使用溫度差別引入的不確定度分量u(50)2，20 ℃時水的體積膨脹系數(shù)α為2.1×10-3℃-1，校正溫度為20 ℃，而本次實驗是在恒溫25 ℃條件下進行的，取均勻分布k=，則

合成50 mL容量瓶引入的不確定度：

③由0.50 mL分度吸量管引入的相對標準不確定度u(0.50)

0.50 mL A級分度吸量管的最大允差為±0.005mL，按均勻分布，

④因為在配制過程中使用2次50 mL容量瓶，因此配制內(nèi)標工作液引入的相對標準不確定度u(is)2

合成內(nèi)標工作液濃度cis的不確定度u(cis)，

2.3.1.4 加入樣品中內(nèi)標工作液濃度Vis的標準不確定度u(Vis)

樣品中加入內(nèi)標工作液的體積Vis為0.10 mL，0.5 mL多標移液管的最大允差為±0.005 mL，按均勻分布k=，計算得：

2.3.1.5 合成不確定度u(c)

2.3.2 最終定容體積引入的相對不確定度u(V)

樣品經(jīng)萃取、凈化和氮吹濃縮近干后，用5.00 mL單標移液管移取50%甲醇水溶液溶解后過濾膜上機測試。5 mL單標移液管的B級容量允差為0.020 mL，按均勻分布k=，計算得：

2.3.3 稱量樣品（m）引入的相對不確定度u(m)

采用百分之一分析天平稱量樣品5.00 g，由檢定證書給出其分度值為0.01 g，取均勻分布k=，則

2.3.4 合成不確定度u(X)及擴展不確定度u

樣品中氯霉素殘留量面積比的平均值A(chǔ)=0.448，按擬合方程y=0.6112x+0.0022計算得

取置信水平為95%，包含因子k=2，則

u=2×u(X)×X=0.025 1 μg·kg-1

修約為 u=0.025μg·kg-1

則蜂蜜中氯霉素殘留量的測定結(jié)果為（0.729±0.025） μg·kg-1。

3 結(jié)論

在蜂蜜中氯霉素殘留量測定中不確定度來源的評定中，對該過程中部分不確定度的來源進行了合理忽略，主要氯毒素和內(nèi)標峰面積之比的不確定度、標準曲線斜率a及截距b的不確定度、內(nèi)標工作液濃度cis的不確定度以及加入樣品中內(nèi)標工作液體積Vis的不確定度、最終定容體積的不確定度以及稱取樣品引入的不確定度等7個方面對測定結(jié)果進行了不確定度評定。從統(tǒng)計數(shù)值分析，不確定度的主要來源氯霉素和內(nèi)標峰面積之比的不確定度和內(nèi)標濃度的不確定度，應(yīng)采取適當措施，盡可能減少由此引入的不確定度。