整合素α2β1 和CD44V3 表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理關(guān)系探究

尤 鑫 趙向寨 楊 雪 溫彥靜

1．天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院( 300100) ;2．河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院;3．河北省中醫(yī)院

宮頸鱗癌是女性［1］發(fā)展隱蔽，確診時(shí)已不同程度的浸潤、轉(zhuǎn)移，尋找宮頸鱗癌的早期診斷指標(biāo)尤為重要。宮頸鱗癌的浸潤、轉(zhuǎn)移涉及多種基因的調(diào)控，腫瘤細(xì)胞之間以及與基質(zhì)間的黏附力改變、腫瘤細(xì)胞的遷移與增生能力以及血管的形成等。其發(fā)生主要因素是細(xì)胞間黏附力的變化及癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的相互作用［2-3］。所以，細(xì)胞黏附分子在腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。整合素α2β1 作為黏附分子，主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和遷移而提高腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。黏附分子CD44V3，也能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散［4］。整合素α2β1、CD44V3 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，尤其是浸潤與轉(zhuǎn)移的過程中起著重要的作用。本研究探討宮頸鱗癌組織和宮頸非癌組織中上述指標(biāo)蛋白表達(dá)差異在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。同時(shí)，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)( RT-PCR) 技術(shù)檢測兩者在組織中mRNA 的表達(dá)，從基因水平探討其與宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 基本資料

收集2015 年1 月—2017 年1 月間本院病例標(biāo)本72 例，其中確診［5］為宮頸鱗癌標(biāo)本36 例( 宮頸鱗癌組) ，年齡( 55．4±6．8) 歲( 34～68 歲) ;角化型16例，非角化性型20 例;PTNM 分期I ～I(xiàn)I 期19 例，III～I(xiàn)V 期17 例;淋巴轉(zhuǎn)移25 例，無淋巴轉(zhuǎn)移11 例;浸潤深度T1～T216 例，T3～T4 20 例;患者術(shù)前均未接受放化療。同期子宮平滑肌瘤手術(shù)切除的良性病變宮頸黏膜組織標(biāo)本36 例( 對照組) ，年齡( 56．0±5．7) 歲( 32～73 歲) ，所有臨床資料完整，兩組年齡比較無差異( t=0．418，P=0．677) 。本研究得到本院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 標(biāo)本處理 手術(shù)切除組織標(biāo)本后，部分標(biāo)本10%中性福爾馬林溶液固定，逐級脫水、透明、常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，用于免疫組化SP 法染色實(shí)驗(yàn);另一部分標(biāo)本立即儲存于-80℃冰柜中，用于提取RNA，行RT-PCR。

1．2．2 RT-PCR 檢測 檢測兩組標(biāo)本中整合素α2β1 mRNA、CD44V3 mRNA 的表達(dá)。組織標(biāo)本立刻置于-80℃冰柜備用，提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄及基因擴(kuò)增合成整合素α2β1 和CD44V3 基因片段，瓊脂糖凝膠電泳，并經(jīng)成像系統(tǒng)采圖，用Quantity One 軟件分析其相對表達(dá)量。

1．2．3 檢測結(jié)果分析 使用β?actin 作內(nèi)參照，將擴(kuò)增產(chǎn)物用1．5%瓊脂糖凝膠電泳，通過成像系統(tǒng)Quantity One 采圖后進(jìn)行相對表達(dá)量分析。

1．3 陽性表達(dá)判定［6-7］

整合素α2β1 和CD44V3 的陽性水平采用陽性細(xì)胞數(shù)評分及染色強(qiáng)度評分綜合判定。陽性細(xì)胞數(shù)評分:×200 倍顯微鏡下，隨機(jī)4 個(gè)視野( 每個(gè)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)100 個(gè)) ，染色并統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞記分，陽性細(xì)胞率＜10%為0 分，10%～25%為2 分，26%～50%為2 分，＞50%為3 分;染色強(qiáng)度評分，與背景色一致為0 分( 陰性) ，略深于背景色為1 分，中等黃色為2分，呈棕黃色或棕褐色( 且細(xì)胞漿也著色) 為3 分。綜合判定:0 分為( -) ，1～2 分為( +) ，3 ～4 分為( ++) ，5～6 分為( +++) 。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS19．0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，蛋白水平計(jì)算率，組間比較采用檢驗(yàn); 基因水平計(jì)算均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較使用t 檢驗(yàn); 整合素α2β1 和CD44V3 相關(guān)性采用Spearman 分析。P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 宮頸鱗癌組整合素α2β1 和CD44V3 的表達(dá)

電泳圖中可見在198bp 和100bp 處有特異性反應(yīng)條帶，分別是整合素α2β1 和β?actin 的電泳片段，以整合素α2β1 和β?actin 的灰度掃描值的比值作為整合素α2β1 mRNA 的表達(dá)值( 圖1) ; 電泳圖中可見在353bp 和100bp 處有特異性反應(yīng)條帶，分別是整合素CD44V3 和β?actin 的電泳片段，以整合素CD44V3 和β?actin 的灰度掃描值的比值作為整合素CD44V3mRNA 的表達(dá)值( 圖2) 。

2．2 兩組整合素α2β1mRNA 和CD44V3 mRNA 的表達(dá)

整合素α2β1mRNA、CD44V3mRNA 的表達(dá)值對照組( 0．09±0．03、0．13±0．02) 均低于宮頸鱗癌組( 0．52±0．08、0．65±0．11) ( P＜0．05) 。見圖3。

2．3 兩組整合素α2β1 和CD44V3 的表達(dá)

整合素α2β1 和CD44V3 在宮頸鱗癌組織中陽性率均高于對照組( P＜0．05) 。見表1。

圖1 α2β1 mRNA 在宮頸鱗癌中的表達(dá)

圖2 CD44V3mRNA 在宮頸鱗癌中的表達(dá)

圖3 兩組整合素α2β1mRNA 和CD44V3 mRNA 的表達(dá)情況比較

表1 整合素α2β1 和CD44V3 在兩組中的表達(dá)(例)

2．4 宮頸鱗癌組整合素α2β1 和CD44V3 與臨床資料關(guān)系

整合素α2β1 和CD44V3 的陽性表達(dá)與宮頸鱗癌患者的年齡無相關(guān)性( P＞0．05) ，但與患者的PTNM 分期、分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度存在相關(guān)性( P 均＜0．05) 。見表2。

2．5 整合素α2β1 與CD44V3 在宮頸鱗癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析

整合素α2β1 和CD44V3 在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)性( r=0．369，P＜0．05) 。見表3。

表2 宮頸鱗癌組臨床指標(biāo)與整合素α2β1 和CD44V3 關(guān)系比較

表3 整合素α2β1 與CD44V3 在宮頸鱗癌組織中表達(dá)的相關(guān)性(例)

3 討論

宮頸癌為全球婦女第二大惡性疾病，其發(fā)病率和死亡率呈遞增趨勢［8］。目前臨床90%就診宮頸癌患者均處于進(jìn)展期，即確診時(shí)已發(fā)生不同程度的局部浸潤、轉(zhuǎn)移［9］。所以尋找宮頸癌的早期診斷指標(biāo)和特異性作用途徑抑制轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，將可能有效阻止并控制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［10］。宮頸鱗癌的浸潤、轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多階段、復(fù)雜性的連續(xù)發(fā)展過程，最終結(jié)局是形成轉(zhuǎn)移瘤［11］。

整合素α2β1 主要是細(xì)胞與I 型膠原蛋白作用的功能性受體，α2 亞基與基質(zhì)成分特異性黏附，β1亞基通過其細(xì)胞內(nèi)片段與細(xì)胞骨架連接，參與細(xì)胞信號的傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞與膠原蛋白相互作用及腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移過程中的各個(gè)基本環(huán)節(jié)［12］。通過識別與細(xì)胞外基質(zhì)配體上特殊氨基酸結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM 間黏附，導(dǎo)致腫瘤與周圍組織黏附;通過黏附作用以及信號傳導(dǎo)作用，參與炎癥的反應(yīng)、創(chuàng)傷的愈合、腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移、血栓的形成、免疫應(yīng)答等生理病理過程。既往研究已表明，整合素α2β1 的黏附作用對維持組織完整和促進(jìn)細(xì)胞遷移等重要作用［13］。整合素α2β1 的信號傳導(dǎo)作用具有雙向性，從而影響基因的表達(dá)，細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為。本研究觀察到，宮頸鱗癌組整合素α2β1mRNA 的表達(dá)值、陽性率均高于對照組。與相關(guān)研究報(bào)道，在腫瘤組織及非腫瘤組織中，整合素α2β1 的表達(dá)水平存在差異，在胃癌的患者中整合素α2β1、α5 及α6 均呈持續(xù)高表達(dá)水平一致［14］。

CD44 廣泛存在于細(xì)胞表面的一種跨膜糖蛋白，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，其結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生顯著變化而影響轉(zhuǎn)化后腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移行為的粘附分子，在體內(nèi)分布極廣泛，能與透明質(zhì)酸等多種配體結(jié)合，參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附。CD44V 包括CD44V1 ～CD44V10，其中與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移較為密切相關(guān)的是CD44V3、CD44V6 及CD44V9。CD44V3 能與透明質(zhì)酸和細(xì)胞外基質(zhì)成分等結(jié)合，參與細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-外基質(zhì)間的粘附過程［15］。劉暉等［16］發(fā)現(xiàn)CD44V3 基因蛋白在早期宮頸鱗癌的表達(dá)明顯高于良性病變，在正常宮頸組織中未見表達(dá)，說明了CD44V3 在早期宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，與宮頸鱗癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移灶有顯著相關(guān)性。Amaral 等［17］研究了黏附因子CD44V3 在正常絨毛、葡萄胎及絨癌中的表達(dá)及相關(guān)性，結(jié)果顯示CD44V3 的過表達(dá)促進(jìn)了葡萄胎、絨癌的浸潤和轉(zhuǎn)移，作為葡萄胎、絨癌浸潤、轉(zhuǎn)移及評價(jià)預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌組的CD44V3mRNA 的表達(dá)值、陽性率均高于對照組?？捣f竹、Martins等［18-19］研究原發(fā)胃癌組織發(fā)現(xiàn)，CD44v3 的表達(dá)與胃癌的臨床分級有關(guān)。鑒于此，我們進(jìn)一步分析了整合素α2β1 和CD44V3 與宮頸鱗癌臨床資料的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，整合素α2β1 和CD44V3 的陽性表達(dá)與宮頸鱗癌患者的年齡無明顯相關(guān)性，但與宮頸鱗癌患者的PTNM 分期、分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度均存在明顯相關(guān)性; 整合素α2β1 與CD44V3 之間陽性表達(dá)率相關(guān)性分析顯示，整合素α2β1 和CD44V3 在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)性。表明腫瘤細(xì)胞中整合素α2β1 及CD44v3 的高表達(dá)與腫瘤的惡化程度有關(guān)，與宮頸鱗癌的生物學(xué)行為有關(guān)。本研究也存在一定局限性，樣本例數(shù)較少，且僅為單中心研究，但結(jié)果可為以后大樣本多中心研究提供參考。

綜上所述，整合素α2β1 和CD44V3 在宮頸鱗癌組織中呈高表達(dá)水平，且其與患者的PTNM 分期、分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度密切相關(guān)，整合素α2β1 和CD44V3 聯(lián)合檢測可為宮頸鱗癌患者的診治及預(yù)后評估提供參考。