魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進展

董安然 成智麗 張彤 王宏宇 柏彬彬

(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院；遼寧省水生生物重點實驗室，遼寧大連 116023)

魚類是人類重要的蛋白質(zhì)來源之一，且具有懷卵量大、體外發(fā)育，易于觀察等特點。因此，魚類不但是重要的經(jīng)濟動物也是研究中常用的模式動物。轉(zhuǎn)基因技術(shù)有效打破了動物細胞接納外源基因的進化壁壘，能將人為篩選改造過的基因遺傳給下一代。相比于傳統(tǒng)育種，為培育和改良優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、抗逆性強的魚類新品系提供了更高效的途徑。1985年，朱作言等研制出世界首例轉(zhuǎn)基因魚并建立了第一個轉(zhuǎn)基因魚模型，隨后英國、法國、美國等幾十個實驗室開始了轉(zhuǎn)基因魚的研究[1]。近幾年，美國批準了轉(zhuǎn)基因大西洋鮭(Salmosalar)上市，成為全球第一例準入市場的轉(zhuǎn)基因動物食品[2]。極大促進了培育安全可靠轉(zhuǎn)基因魚新品種的步伐。

1 魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要原理及方法

1.1 魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要原理

魚類轉(zhuǎn)基因是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，人工操作把外源目的基因?qū)胄约毎?，使外源目的基因整合到動物本身的基因組中，從而外源目的基因隨胚胎發(fā)育賦予受體動物新的生物學(xué)性狀并穩(wěn)定遺傳給后代。如果外源目的基因整合到動物的部分細胞的基因組中,叫作嵌合體動物；而動物所有的細胞均整合外源目的基因,并具有將外源基因遺傳給下一代的能力,叫作轉(zhuǎn)基因動物?？梢哉f，魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)是分子生物學(xué)、細胞學(xué)、遺傳學(xué)、胚胎學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科的綜合應(yīng)用[3]。

不論是原核顯微注射法等物理手段，或者DEAE-葡聚糖法等化學(xué)手段，還是逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的生物手段，其目的是將外源目的基因?qū)胄约毎?，重點在于外源目的基因的整合與表達效率。通過對生物基因與表現(xiàn)型進行分析,從而了解外源目的基因的功能。

1.2 修飾外源目的基因常用方法

1.2.1 鋅指核酸酶技術(shù)

ZFN ( zinc finger endonuclease )，鋅指核酸酶是第一代人工核酸內(nèi)切酶。鋅指核酸酶包括DNA切割結(jié)構(gòu)域FokI和鋅指結(jié)構(gòu)的DNA識別結(jié)構(gòu)域兩部分。FokI內(nèi)切酶只有形成二聚體才有活性，DNA識別域包含3個或更多的Cys2-His2鋅指蛋白。這些鋅指蛋白每個可與3個連續(xù)的堿基對相互作用。ZFN技術(shù)開啟了基因組靶向修飾技術(shù)的大門，與同源重組相比大大提高了基因編輯效率，其缺點在于細胞毒性和脫靶現(xiàn)象，且成本相對昂貴，所以被TALEN取代。

1.2.2 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)

TALEN( transcription activator-like effector nuclease)，類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶是第二代人工核酸內(nèi)切酶，包括人工改造的核酸內(nèi)切酶切割域FokI以及DNA識別域。DNA的識別區(qū)域包含許多重復(fù)保守的氨基酸序列模塊組，其中每34個氨基酸組成一個模塊，第12位、第13位氨基酸種類可變，決定了模塊識別靶向點的特異性。TALEN與ZFN相似的是都是由一個結(jié)合域、DNA序列識別區(qū)以及一個DNA切割域構(gòu)成的，不同的是TALEN的兩個單體尾對尾對靶DNA進行特異性識別、結(jié)合，具有切割活性的非特異性二聚體FokI實現(xiàn)識別和切割。相比于ZFN，TALEN具有使基因操作簡便、低毒性、低脫靶率等優(yōu)點。但制約TALEN應(yīng)用推廣的因素在于其模塊組裝費時費力。

1.2.3 CRISPR/CAS核酸酶技術(shù)

CRISPR/CAS 9系統(tǒng)，成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列關(guān)聯(lián)蛋白是第三代人工內(nèi)切酶技術(shù)，CRISPR系統(tǒng)有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三種類型，CRISPR/CAS 9是由結(jié)構(gòu)較為簡單的Ⅱ型系統(tǒng)為基礎(chǔ)衍生而來。其原理簡述為crRNA-tracrRNA形成RNA雙鏈導(dǎo)向RNA分子(sgRNA)，sgRNA與CAS 9蛋白結(jié)合，進而實現(xiàn)對靶DNA的編輯。其較前兩代的優(yōu)勢在于成本低、制作簡單、效率高、適用性廣。

基因編輯技術(shù)在轉(zhuǎn)基因魚類的研究中，主要應(yīng)用在基因敲除、基因定點整合和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控三方面。對于培育新品系，實現(xiàn)多基因調(diào)控性狀的改良，基因編輯技術(shù)具有廣闊的前景和重要意義。近年來，利用基因編輯技術(shù)在斑馬魚的研究中，進行基因敲除實驗和轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?。日本學(xué)者(2014年)運用CRISPR/CAS 9技術(shù)，對evx2 基因位點和eng1b 基因位點進行修飾，用顯微注射法注射到斑馬魚性細胞系中，成功將外源目的基因整合并表達；劉斐斐(2017年)等利用CRISPR/CAS 9技術(shù)有效將外源目的基因整合到斑馬魚基因組的特定位置，通過顯微注射法將eGFP熒光蛋白導(dǎo)入斑馬魚性細胞系中，獲得了51.72%的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。

1.3 魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)的常用方法

1.3.1 顯微注射法

顯微注射法是借助顯微鏡的放大技術(shù)，直接將外源目的基因注射到魚類卵母細胞、受精卵、早期胚胎、胚胎干細胞活體細胞中，然后生產(chǎn)個體的方法。此方法是制備轉(zhuǎn)基因生物最簡單可靠的方法，其應(yīng)用范圍廣，轉(zhuǎn)基因長度可達數(shù)百kb，即盡量在合子(受精卵)形成早期導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的DNA，當精子和卵細胞結(jié)合，DNA就被直接注射入細胞中，不需要載體。因此，不存在擾亂該過程的外源基因序列。其缺點在于導(dǎo)入的基因隨機整合在染色體DNA上，有時會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物基因組的重排、易位、缺失或點突變。顯微注射法應(yīng)用依賴于魚類卵母細胞體外成熟技術(shù)，至今報道的卵母細胞能在體外條件下完全成熟的只有金魚、斑馬魚和青鳉3種[3]。在斑馬魚、大西洋鮭魚、鯉魚、美國鲇魚、泥鰍魚、鯽魚等轉(zhuǎn)基因研究中廣泛采用此方法。1986年，Ozato等用顯微注射法將外源目的基因SV40PcCr導(dǎo)入青鳉魚體內(nèi)成功獲得了轉(zhuǎn)基因魚[4]。

1.3.2 電穿孔法

電穿孔法是利用脈沖電場提高細胞膜的通透性，在細胞膜上形成納米大小微孔，使外源目的基因轉(zhuǎn)移到細胞中。此方法可大批處理受精卵且操作簡便，但外源基因?qū)腚S機且轉(zhuǎn)移頻率相對較低[3]。1992年，Buono等用此技術(shù)成功使乙酰轉(zhuǎn)移酶基因在斑馬魚體內(nèi)表達[5]。

1.3.3 精子載體介導(dǎo)法

該方法是將精子作為外源目的基因運載工具，用人工授精的方法導(dǎo)入卵內(nèi)的技術(shù)。其優(yōu)點是準確性極高，且省略了顯微注射等方法的復(fù)雜過程和設(shè)備；缺點在于難以高效地將外源目的基因?qū)刖蛹毎?。目前，根?jù)外源目的基因的導(dǎo)入形式等，又可分為直接混合法、電穿孔精子載體法、脂質(zhì)體法三種。1989年，沈孝宙用鯉精子作為運載工具，成功獲得超過50%明顯表達生長素的轉(zhuǎn)基因魚[6]。

1.3.4 基因槍法(微彈轟入法)

基因槍法是用吸附DNA的鎢微粒子高速轟擊受體細胞，從而達到轉(zhuǎn)移外源目的基因的目的。此方法在植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域應(yīng)用較多。其優(yōu)點在于可在短期內(nèi)處理多個細胞。但由于其穩(wěn)定性和表達的問題，以及魚類的卵核小而卵黃大的特點，導(dǎo)致該方法應(yīng)用較少[3]。1990年，Zelenin等用基因槍法將含有半乳糖酶和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的目的基因序列成功轉(zhuǎn)移到虹鱒、歐洲泥鰍和斑馬魚的胚胎中[7]。

此外，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)還有染色體片段微注入法、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法、胚胎干細胞介導(dǎo)法、磷酸鈣共沉淀法、激光處理法、DEAE-葡聚糖法等。但在魚類轉(zhuǎn)基因研究中，還沒有較為成功的報道。

2 魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究方向

2.1 抗病育種

轉(zhuǎn)基因動物研究中，抗病育種一直作為一個研究熱點，在魚類轉(zhuǎn)基因的研究中對比畜牧轉(zhuǎn)基因抗病育種工作，開展的工作相對晚一些。2004年，Mao等使用電穿孔法將hLF基因的cDNA轉(zhuǎn)入草魚的性細胞系中，獲得了超過55%的對嗜水氣單胞菌抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因草魚；2005年，EL-Zaeem and Assem將鯊魚的DNA注射到了羅非魚性細胞系中，獲得了具有抗體活性高、免疫球蛋白大量提高的轉(zhuǎn)基因魚類。

2.2 性狀改良

魚類的品種改良涉及到魚的生長速度、適應(yīng)性、營養(yǎng)組成和抗逆性等。對比傳統(tǒng)育種通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對魚類進行品種改良可以極大縮短改良進程。在最早的轉(zhuǎn)基因魚類的研究中，首先是導(dǎo)入生長激素基因(GH)加快生長速度，提高經(jīng)濟效益。2000年，Martinez等成功從鮭魚提取生長激素，導(dǎo)入了羅非魚性細胞系中，在CMV啟動子驅(qū)動下，成功培育出食物轉(zhuǎn)化率顯著提高2.9倍的轉(zhuǎn)基因魚。在品種改良中，抗凍蛋白的轉(zhuǎn)基因魚類培育也是轉(zhuǎn)基因的熱點，但此前的轉(zhuǎn)抗凍蛋白基因魚類都未達到預(yù)期效果。2005年，Dunham等將轉(zhuǎn)抗凍蛋白的斑點叉尾鮰置入土池，存活率對比非轉(zhuǎn)基因斑點叉尾鮰約提高40%。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對魚類進行品種改良育種，將是未來的重要研究方向。

2.3 模式生物

魚類具有個體適中，世代周期短、胚胎透明、體外發(fā)育等特點，斑馬魚是魚類中較有代表性的種類。因此，轉(zhuǎn)基因魚類作為模式生物對于基因的表達調(diào)控、形態(tài)發(fā)生發(fā)育、環(huán)境監(jiān)測藥物篩選等領(lǐng)域具有獨特優(yōu)勢。2009年，夏銘等成功用轉(zhuǎn)基因斑馬魚構(gòu)建了胰島素β-細胞發(fā)育模型；2013年，蒲韻竹等用轉(zhuǎn)基因斑馬魚建立了阿爾茨海默病動物模型[10]。隨著多種魚類基因組測序工作的完成，我們看到了魚類作為模式生物的廣闊前景，為人類在疾病治療、疾病機理、藥物研發(fā)等領(lǐng)域提供了更多科學(xué)依據(jù)。

3 魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展趨勢

3.1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與多種生物技術(shù)結(jié)合發(fā)展

近幾年，轉(zhuǎn)基因魚類的研究主要集中在提高生長速度、抗逆抗病育種等與經(jīng)濟效益有關(guān)的研究工作，但隨著分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的不斷突破，魚類轉(zhuǎn)基因研究將越來越呈現(xiàn)多學(xué)科交叉的特點。最近，我國我國完成了大量魚類的基因組測序和功能基因注釋工作，包括鯉魚、草魚、大黃魚等，將已知魚類的優(yōu)良性狀通過轉(zhuǎn)基因平臺，可以廣泛的開展轉(zhuǎn)基因魚類的育種工作?；蚓庉嫾夹g(shù)的發(fā)展不僅顯著提高了轉(zhuǎn)基因效率，還在外源目的基因的定點整合中，對轉(zhuǎn)基因魚類的研究起到了不可替代的作用。未來的魚類轉(zhuǎn)基因，將會越來越依靠分子生物學(xué)、細胞學(xué)、遺傳學(xué)、胚胎學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科等學(xué)科的理論技術(shù)突破，完成自身的創(chuàng)新發(fā)展。

3.2 重要功能基因來源多樣化

隨著基因組、蛋白組等“組學(xué)”的發(fā)展，以及基因組測序、高通量基因篩選、基因組關(guān)聯(lián)分析等技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，外源目的基因的來源呈現(xiàn)多樣化趨勢，可以從微生物、動物、植物等挖掘出抗旱、抗寒、抗蟲、營養(yǎng)改良等功能豐富的基因。魚類作為脊椎動物門中占半數(shù)以上的種類，其繁殖周期和繁殖數(shù)量的優(yōu)勢明顯，將會成為功能基因的“重要產(chǎn)地”和性狀輸出生物，為轉(zhuǎn)基因育種研究注入新的動力。

3.3 多基因復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因魚的研發(fā)

轉(zhuǎn)基因魚類在研發(fā)初期主要集中在單一功能的外源目的基因上。隨著生物技術(shù)的不斷進步，多基因復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將成為研發(fā)重點。多基因不僅能夠使性狀協(xié)同表達，還會大大提高基因轉(zhuǎn)化率。未來轉(zhuǎn)基因魚將具有肉質(zhì)好、生長快、耐低溫低氧等許多復(fù)合優(yōu)良性狀。

3.4 轉(zhuǎn)基因魚類作為生物反應(yīng)器的研發(fā)

生物反應(yīng)器是指通過轉(zhuǎn)基因生物對外源目的基因的高效率表達，進而工業(yè)化生產(chǎn)功能蛋白質(zhì)的技術(shù)?，F(xiàn)在，世界許多公司利用轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器生產(chǎn)醫(yī)用蛋白，例如β-乳球蛋白、hFVIII和紅細胞生成素等。但以轉(zhuǎn)基因魚類作為生物反應(yīng)器的研究還相對滯后，魚類作為高產(chǎn)量、低成本的生物反應(yīng)器優(yōu)勢明顯。隨著魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟，魚類作為生物反應(yīng)器必將迎來屬于自己的時代。