奇異變形桿菌抑制犬乳腺腫瘤小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)和肺臟轉(zhuǎn)移

張 紅,賈麗欣,袁瑜璟,張 迪,金藝鵬,林德貴

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193;2.海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院,海南 ?？?570228)

犬乳腺腫瘤是未絕育母犬最常見的腫瘤,據(jù)報(bào)道發(fā)病率約為200/100,000犬/年[1-2]。由于我國(guó)寵物主人對(duì)犬絕育的意識(shí)較差,導(dǎo)致發(fā)病率可能遠(yuǎn)高于這個(gè)比例。患犬可能有一個(gè)或多個(gè)乳腺腫瘤,研究發(fā)現(xiàn)約50%乳腺腫瘤為惡性腫瘤[3]。腫瘤的直徑大于1 cm,腫瘤的轉(zhuǎn)移已經(jīng)發(fā)生,手術(shù)切除更加容易誘發(fā)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[4-5]。常規(guī)的化療藥物對(duì)乳腺腫瘤的效果有限,且會(huì)造成動(dòng)物的免疫抑制和其他不良反應(yīng),故需要開發(fā)更佳的治療方案來治療腫瘤病例。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),某些厭氧或兼性厭氧細(xì)菌能夠在腫瘤的缺氧環(huán)境定植和增殖,通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)和爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)等方面發(fā)揮抗腫瘤的作用[6-7]。奇異變形桿菌是革蘭陰性腸桿菌,屬兼性厭氧菌,泌尿道的條件致病菌。我們研究發(fā)現(xiàn),奇異變形桿菌(ATCC 35659)能夠在犬乳腺腫瘤異種移植小鼠模型的腫瘤內(nèi)聚集增殖,抑制腫瘤的生長(zhǎng),抑制肺臟轉(zhuǎn)移的發(fā)生,可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體的局部免疫反應(yīng)發(fā)揮這種治療效果。

1 試驗(yàn)和方法材料

1.1 荷瘤小鼠模型的制備 使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(Gibco)CMT-7364犬乳腺腫瘤細(xì)胞系,腫瘤細(xì)胞達(dá)到80% ～90%融合時(shí),胰蛋白酶消化細(xì)胞,重懸。將107個(gè)CMT-7364犬乳腺腫瘤細(xì)胞注射至5月齡雌性BABL/c小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)的左側(cè)乳房墊內(nèi),每周進(jìn)行觀察。

1.2 奇異變形桿菌的準(zhǔn)備 奇異變形桿菌(ATCC 35659)由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院藥理系饋贈(zèng)。使用LB肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)奇異變形桿菌,使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h,計(jì)數(shù)細(xì)菌單菌落形成單位(CFU),以備后期使用。

1.3 細(xì)菌在小鼠體內(nèi)生物分布的觀察 小鼠的乳腺腫瘤直徑達(dá)到5～8 mm時(shí),隨機(jī)分為兩組,細(xì)菌治療組(BAC)和試驗(yàn)對(duì)照組(CON),每組5只小鼠。細(xì)菌治療組尾靜脈注射奇異變形桿菌,劑量為5×106CFU/只;試驗(yàn)對(duì)照組尾靜脈注射磷酸鹽緩沖液(PBS)。于注射后的0 h、24 h和96 h觀察小鼠腫瘤的大體變化,在無菌條件下取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腫瘤組織研磨后LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌,37℃培養(yǎng)24 h后,進(jìn)行細(xì)菌CFU計(jì)數(shù)。

1.4 異種移植腫瘤的生長(zhǎng)情況評(píng)估 小鼠的乳腺腫瘤直徑達(dá)到5～8 mm時(shí),隨機(jī)分為兩組,細(xì)菌治療組(BAC)和試驗(yàn)對(duì)照組(CON),每組6只小鼠。細(xì)菌治療組尾靜脈注射奇異變形桿菌,劑量為5×106CFU/只,試驗(yàn)對(duì)照組尾靜脈注射 PBS,每周1次,一共3次。每隔3 d,使用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腫瘤的長(zhǎng)和寬,稱量小鼠的體重。每周觀察小鼠的飲水、飲食、精神狀態(tài)和身體情況,如發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)跛行、極度萎靡或惡病質(zhì),脫頸處死小鼠,并記錄。21 d治療結(jié)束后脫頸處死小鼠,取小鼠的腫瘤稱重,取心臟、肝臟、脾臟和腎臟用福爾馬林固定,制備病理組織切片,觀察各個(gè)器官是否發(fā)生病理變化。用福爾馬林固定小鼠的腫瘤,脫水,包埋后,進(jìn)行Ki-67(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),免疫組織化學(xué)染色,以評(píng)估腫瘤細(xì)胞的增殖情況。

1.5自發(fā)性肺臟轉(zhuǎn)移情況的評(píng)估 21 d治療結(jié)束的小鼠脫頸處死后,取完整的肺臟于福爾馬林中固定24 h后,取出計(jì)數(shù)肺臟表面自發(fā)性轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。制備病理組織切片,對(duì)隨機(jī)選取的5個(gè)視野拍照,Image Plus Pro軟件分析肺臟的轉(zhuǎn)移面積。

1.6 ELISA檢測(cè) 小鼠異種移植的乳腺腫瘤直徑達(dá)到5～8 mm時(shí),尾靜脈注射奇異變形桿菌,劑量為5×106CFU/只。細(xì)菌注射后24 h和96 h,眼球放血處死小鼠,采集對(duì)照組和細(xì)菌治療組小鼠的血清和腫瘤,腫瘤組織研磨后,進(jìn)行TNF-α和IL-6細(xì)胞因子的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)(購(gòu)自Abcam公司)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 上述獲得的數(shù)據(jù),以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。使用GraphPad Prime 5采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和制圖,以P＜0.05為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌能在小鼠異種移植的腫瘤內(nèi)聚集 恒溫箱培養(yǎng)組織研磨液發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能在腫瘤和其他器官被檢測(cè)到。心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的細(xì)菌數(shù)量隨時(shí)間增加而降低,腫瘤的細(xì)菌含量隨著時(shí)間增加而增加,說明細(xì)菌能夠在小鼠異種移植的腫瘤內(nèi)特異性地生長(zhǎng)和聚集(見中插彩版圖1A)。奇異變形桿菌治療后的24 h和96 h后大體觀察發(fā)現(xiàn)異種移植的腫瘤發(fā)生潰瘍(見中插彩版圖1B)。腫瘤病理組織學(xué)H.E.染色切片顯示尾靜脈注射細(xì)菌后腫瘤細(xì)胞發(fā)生了死亡和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見中插彩版圖1C)。

2.2 細(xì)菌抑制腫瘤的生長(zhǎng) 根據(jù)公式V=a×b2/2(a代表腫瘤的長(zhǎng),b代表腫瘤的寬),計(jì)算小鼠異種移植腫瘤的體積,結(jié)果顯示,細(xì)菌治療組與對(duì)照組相比腫瘤體積較小,統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著;細(xì)菌注射后腫瘤質(zhì)量顯著減輕;免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,細(xì)菌治療后腫瘤細(xì)胞的Ki-67表達(dá)降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著(見中插彩版圖2)。上述結(jié)果表明,奇異變形桿菌治療能夠顯著地抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。治療初期細(xì)菌治療組的小鼠體重減輕,但治療后期體重恢復(fù),兩組之間沒有顯著性差異(見中插彩版圖2F),說明細(xì)菌治療在一定程度來說是安全的。

2.3 細(xì)菌抑制肺臟自發(fā)性轉(zhuǎn)移 21 d治療結(jié)束后,計(jì)數(shù)肺臟自發(fā)性轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量發(fā)現(xiàn)細(xì)菌治療能夠顯著地抑制肺臟自發(fā)性轉(zhuǎn)移灶的形成。分析肺臟轉(zhuǎn)移面積的結(jié)果表明,細(xì)菌治療后肺臟轉(zhuǎn)移面積顯著減少(見中插彩版圖3)。上述結(jié)果表明,細(xì)菌能夠抑制肺臟的自發(fā)性轉(zhuǎn)移。

2.4 細(xì)菌調(diào)節(jié)腫瘤局部免疫反應(yīng) ELISA檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)菌注射24 h和96 h后血清中IL-6的表達(dá)沒有明顯改變;24 h后腫瘤研磨液的IL-6表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。細(xì)菌注射后24 h和96 h后血清的TNF-α表達(dá)沒有明顯改變;細(xì)菌注射24 h后腫瘤TNF-α的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)(見圖4)。上述結(jié)果說明細(xì)菌治療后可能調(diào)節(jié)腫瘤局部的免疫反應(yīng)來發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)和肺臟轉(zhuǎn)移的作用。

3 展望與小結(jié)

圖4 細(xì)菌處理后小鼠血清和腫瘤中IL-6和TNF-α的表達(dá)

細(xì)菌治療是個(gè)危險(xiǎn)的嘗試,但我們的研究過程中沒有發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的危害。奇異變形桿菌是條件致病菌,對(duì)多種抗生素敏感,如氟喹諾酮類、呋喃妥因、磷霉素、亞胺培南和阿米卡星,能夠很好地控制腫瘤治療過程中出現(xiàn)的副反應(yīng)[8]。故奇異變形桿菌有望安全地應(yīng)用于腫瘤臨床的治療或作為載體轉(zhuǎn)運(yùn)治療性基因或藥物。但臨床應(yīng)用前仍需要對(duì)其進(jìn)行基因改造或其他減毒的措施來保障對(duì)機(jī)體絕對(duì)沒有危害。

細(xì)菌能發(fā)揮治療腫瘤的作用有多種機(jī)制,其中包括免疫調(diào)節(jié)。有研究表明,細(xì)菌治療能夠調(diào)節(jié)血清和腫瘤中TNF-α、IL-6和IL-12等細(xì)胞因子的表達(dá)來對(duì)抗腫瘤[9]。我們的結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn),血清中這些細(xì)胞因子的表達(dá)升高,但發(fā)現(xiàn)細(xì)菌治療24 h后腫瘤研磨液中的TNF-α和IL-6表達(dá)顯著升高。這說明奇異變形桿菌可能只是引起局部的免疫反應(yīng)來發(fā)揮抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移的作用。

以上結(jié)果表明,奇異變形桿菌可能通過調(diào)節(jié)腫瘤局部的免疫反應(yīng)發(fā)揮對(duì)小鼠異種移植腫瘤的生長(zhǎng)和肺臟轉(zhuǎn)移的抑制作用。