一氧化氮在反流性食管炎發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展

肖　姣，朱凌云

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071)

反流性食管炎(RE)是胃、十二指腸等內(nèi)容物如胃酸、胃蛋白酶和十二指腸液反流至食管而引起食管黏膜損傷的一種炎性病變，是胃食管反流病(GERD)的一種。北京與上海兩地在90年代的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示：RE為1.92%[1]。而2007年北京的一項研究顯示，RE的發(fā)病率為4%，表明我國的RE發(fā)病率呈上升的趨勢[2]。其發(fā)病原因有多種，具體機(jī)制還不確切，主要有食管黏膜清除能力下降、食管下括約肌(LES )壓力降低、食管黏膜屏障功能損傷、食管內(nèi)臟高敏性[3]。一氧化氮(NO)作為一種氣體信使分子，在生物體內(nèi)有廣泛的生理和病理意義。近年來關(guān)于NO與RE的發(fā)病機(jī)制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系已經(jīng)取得了一些新的研究進(jìn)展，文章主要綜述近幾年NO與RE發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)展。

1　中醫(yī)病機(jī)

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為RE屬于“吐酸”“嘈雜”“嘔苦”“胸痛”“胃痞”等范疇，而關(guān)于其病機(jī)不同學(xué)者有不同觀點。楊蕓峰等[4]認(rèn)為RE病機(jī)主要為脾失健運，肺胃不降致胃氣上逆，其病位在食管，與肺脾兩臟密切相關(guān)。而屈杰等[5]認(rèn)為RE病機(jī)是肝郁脾虛，胃失和降，病位在食管，與胃、脾、肝關(guān)系密切。賈博等[6]則從李東垣“陰火”理論治RE，認(rèn)為胃陰伏火、痰氣交阻、清氣不升、濁氣不降為其關(guān)鍵病機(jī)。但總體來說其基本病機(jī)為氣機(jī)升降失調(diào)，目前有中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為中醫(yī)的升降理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的胃腸動力類似，而中醫(yī)中藥復(fù)方與NO在RE病機(jī)中的相關(guān)研究也多有報道。馬淑穎等[7]通過實驗發(fā)現(xiàn)疏肝和胃方能降低RE大鼠食管組織中的NO和血管活性腸肽(VIP)的含量來調(diào)節(jié)一過性下食管括約肌松弛(TLESR)的機(jī)制，達(dá)到治療RE的目的。趙艷等[8]發(fā)現(xiàn)化濁解毒方能夠降低大鼠食管黏膜組織VIP和NO的表達(dá)水平，升高黏膜P物質(zhì)(SP)的表達(dá)，改善食管組織的病理損傷，表明化濁解毒方治療機(jī)制可能是調(diào)節(jié)與食管黏膜組織損傷相關(guān)的因子。代二慶等[9]用旋覆代赭湯治療酸性RE模型大鼠發(fā)現(xiàn)能降低食管黏膜NO濃度，減輕炎癥反應(yīng)及減少TLESR的發(fā)作時間和次數(shù)，改善LES松弛。馮云霞等[10]研究調(diào)中顆粒對混合RE大鼠食管黏膜腦腸肽和一氧化氮合酶(NOS)的影響，發(fā)現(xiàn)調(diào)中顆?？赡芡ㄟ^提高SP表達(dá)、減少NOS和VIP的表達(dá)調(diào)節(jié)胃腸運動，從而抑制反流及促進(jìn)黏膜損傷修復(fù)。這些研究雖然將中草藥復(fù)方與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點相結(jié)合，但是并沒有深入探討方藥降低NO的具體機(jī)制。

2　NO與RE的具體機(jī)制

2.1NO對食管黏膜血管的擴(kuò)張作用酸、胃蛋白酶等反流發(fā)作時，食管黏膜血流量增加能加強黏膜抵御損傷的能力。而NO通過調(diào)節(jié)黏膜血管張力可以增加黏膜的血流，能夠供給黏膜以充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，增強食管上皮的保護(hù)作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿、緩釋肽等擴(kuò)血管物質(zhì)可以引起內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，說明NO除了擴(kuò)張血管，還可能是其他血管物質(zhì)的協(xié)同劑或者終末介質(zhì)[12]。另有研究表明，食管黏膜對酸、胃蛋白酶和胰酶等的刺激能迅速進(jìn)行適應(yīng)性保護(hù)，且不通過依靠細(xì)胞增殖而實現(xiàn)，這可能與NO介導(dǎo)的局部作用——增加血流有關(guān)[13]。

Soteras等[14]通過實驗發(fā)現(xiàn)，逐漸加大NOS抑制劑NG-甲基-L-精氨酸(L-NNA) 的使用劑量，食管炎癥程度隨之逐漸加重，說明NO可能參與細(xì)胞保護(hù)作用。Pawlik等[15]用NO釋放的阿司匹林(ASA)衍生物或用NO供體(三硝酸甘油酯)的天然ASA衍生物預(yù)處理動物發(fā)現(xiàn)，這些衍生物對RE食管黏膜有益，其可能的機(jī)制是NO增加了食管黏膜血流量。另外，NO 也可以通過減少炎性因子的相互作用、增加黏液分泌或抑制胃酸等機(jī)制起到黏膜保護(hù)作用[13]。

2.2NO對食管組織的促炎效應(yīng)研究表明，NO也是重要的炎性遞質(zhì)[15]。一般認(rèn)為誘導(dǎo)型NOS(iNOS)產(chǎn)生的NO主要發(fā)揮促炎效應(yīng)，其在正常狀態(tài)下不表達(dá)，需細(xì)胞因子等刺激后才會誘導(dǎo)性表達(dá)，產(chǎn)生的NO達(dá)到一定的濃度(>2 nmol/h)，與超氧化物反應(yīng)產(chǎn)生毒性很強的過氧化亞硝酸(PXN)，PXN加速琉基化合物及脂類的氧化反應(yīng)，引起毒性作用，造成細(xì)胞及組織的損害，發(fā)揮其炎癥遞質(zhì)作用[16]。NO 本身也是氧自由基，在缺血、缺氧狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞內(nèi)iNOS被激活，產(chǎn)生的大量NO可引起細(xì)胞損傷和黏膜炎癥反應(yīng)[17]。說明NO在組織或細(xì)胞內(nèi)可發(fā)揮保護(hù)和毒性雙重效應(yīng)。

Ishiyama等[18]通過給酸性RE模型大鼠口服亞硝酸鈉加抗壞血酸和用iNOS抑制劑PBIT治療，發(fā)現(xiàn)在回流酸的刺激下，通過亞硝酸鈉加抗壞血酸的化學(xué)反應(yīng)在食管細(xì)胞腔內(nèi)產(chǎn)生的NO大大加劇了食管損傷；在亞硝酸鈉加抗壞血酸應(yīng)用7 d后用PBIT治療顯著減輕了由外源性NO暴露產(chǎn)生的食管損傷，而在應(yīng)用后3 d對食管損傷沒有產(chǎn)生明顯影響，表明模型中外源性和內(nèi)源性NO對發(fā)病機(jī)制的影響可能根據(jù)食管損傷發(fā)展的時間過程而不同。雖然早期外源性細(xì)胞腔NO對于擾亂食管上皮功能是重要的，且與回流的胃蛋白酶和胃酸協(xié)同作用，但是一旦保持產(chǎn)生iNOS的大量炎癥細(xì)胞在炎癥組織中積累，內(nèi)源性NO可能在進(jìn)一步加重黏膜損傷中變得更重要。近期發(fā)表在JAMA上的一項研究稱造成GERD的原因可能是免疫反應(yīng)的損傷而不是胃酸等反流導(dǎo)致的化學(xué)性損傷[19]，雖然筆者稱目前該研究不能代表所有的GERD患者，但是這一結(jié)果引起了很多學(xué)者的關(guān)注轉(zhuǎn)移。

2.3NO對食管LES的舒張作用現(xiàn)在已經(jīng)證實，食管環(huán)肌內(nèi)含有大量NO，NO作為一種支配LES的非腎上腺能和非膽堿能(NANC)神經(jīng)遞質(zhì)，可以引起LES松弛，誘發(fā)RE產(chǎn)生。NO 主要通過旁分泌作用調(diào)控食管、胃腸道平滑肌的舒張運動[13]。目前已經(jīng)公認(rèn)的機(jī)制是：一方面NO可能是觸發(fā)TLESR的始動因子[20]，通過激活鳥苷環(huán)化酶(GC)，使環(huán)磷鳥苷(cGMP)增加，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度或?qū)a2+的敏感性，使胞漿游離Ca2+濃度降低，抑制肌球蛋白和肌動蛋白結(jié)合，導(dǎo)致平滑肌松弛，引起LES舒張；另一方面通過激活依賴cGMP的蛋白激酶，使蛋白磷酸化引起LES松弛[13]，在前者神經(jīng)型NOS(nNOS)發(fā)揮主要作用[21]。

以往研究表明，在體外采用負(fù)鼠的LES肌條發(fā)現(xiàn)低濃度的NO可以引起LES舒張[22]；而在人胃食管連接處細(xì)胞腔內(nèi)產(chǎn)生的高濃度NO可以穿透上皮細(xì)胞影響LES的平滑肌細(xì)胞，引起肌肉松弛導(dǎo)致胃內(nèi)容物等反流到食管[23]，而最近的研究表明細(xì)胞腔內(nèi)產(chǎn)生的NO在生理條件下對LES的功能沒有影響[24]，Terai等[25]在2009年也已經(jīng)證明飲食攝入的硝酸鹽在生理條件下不影響胃動力比如胃排空。說明外源性NO可能對LES功能無影響。王薇等[26]證實食管下端括約肌壓力(LESP)與內(nèi)源性NO呈負(fù)相關(guān)，可使LES基礎(chǔ)壓力降低及LES松弛，導(dǎo)致胃等內(nèi)容物反流到食管；郭曉燕等[27]通過實驗發(fā)現(xiàn)nNOS和iNOS主要在食管黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，且在RE患者食管中表達(dá)明顯高于非糜爛性反流病(NERD)組和健康對照組，而其mRNA表達(dá)量也是大于正常組和NERD組，提示nNOS和iNOS可能共同引發(fā)食管平滑肌的收縮和舒張障礙，且隨著病情加劇呈進(jìn)行性加重的趨勢。但這兩項研究都未深入闡明具體機(jī)制。

3　NO介導(dǎo)LES松弛有關(guān)的信號通路

發(fā)揮第二信使的NO可通過與可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)的作用，催化三磷酸鳥苷(GTP)生成環(huán)鳥苷酸(cGMP)，再激活依賴的蛋白激酶G(PKG)，對下游靶蛋白或靶細(xì)胞等發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，即NO-cGMP-PKG途徑[28-30]。LES是位于胃食管連接處特殊增厚的環(huán)行肌，且全由平滑肌組成。在平滑肌的收縮過程中，肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化水平是平滑肌收縮程度的一個重要決定因素，且受到依賴Ca2+/鈣調(diào)蛋白(CaM)的肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和Ca2+非依賴的肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)的雙重調(diào)節(jié)[29，31]。食管的蠕動通常是依賴LES的收縮來實現(xiàn)，而NO介導(dǎo)的cGMP-PKG途徑與上述雙重調(diào)節(jié)方式都有相互聯(lián)系，共同調(diào)節(jié)LES的舒張與收縮反應(yīng)。

3.1鈣依賴性機(jī)制調(diào)節(jié)平滑肌收縮的經(jīng)典機(jī)制為粗肌絲相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制，又稱為Ca2+-CaM-MLCK依賴的機(jī)制[32]。平滑肌細(xì)胞受刺激后，胞外Ca2+內(nèi)流和肌質(zhì)網(wǎng)(SR)Ca2+外流，前者通過刺激膜上鈣通道開放，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，后者主要通過三磷酸肌醇(IP3)與其受體(IP3R)結(jié)合后，引起鈣通道開放，細(xì)胞Ca2+i濃度升高達(dá)閾值后，Ca2+與CaM 結(jié)合，繼而又與MLCK結(jié)合為三元體使其活化MLCK，MLCK催化20 kD MLC上Ser19位點磷酸化，激活肌球蛋白分子上的ATP酶，肌球蛋白磷酸化后與肌動蛋白結(jié)合，發(fā)生相互作用，引起收縮[32-33]；當(dāng)Ca2+濃度下降到一定濃度時，CaM便與MLCK分離，活性消失，不再激活肌球蛋白，而不能與肌動蛋白結(jié)合，導(dǎo)致肌肉松弛[34]。食管中產(chǎn)生的NO還可通過cGMP-PKG途徑抑制IP3生成，減少SR鈣庫釋放Ca2+，使Ca2+濃度迅速下降，LES舒張，導(dǎo)致反流物增多，RE加重[27]。

3.2非鈣依賴性機(jī)制非鈣依賴性機(jī)制調(diào)節(jié)即鈣敏化機(jī)制，其主要機(jī)制是增加了調(diào)節(jié)裝置對Ca2+的敏感性，即通過抑制MLCP，引起MLC磷酸化水平增高，使平滑肌收縮增強[35]。而NO也可通過cGMP-PKG途徑直接激活MLCP使原已磷酸化的MLC脫磷酸而與肌動蛋白分離，抑制肌球蛋白與肌動蛋白相互作用而導(dǎo)致LES松弛[36]。近年來，很多研究[24，37-38]表明RhoA/ROCK通路在鈣敏化機(jī)制中發(fā)揮重要作用。RhoA蛋白屬于小GTP結(jié)合蛋白中的Rho家族，它與GTP結(jié)合后呈現(xiàn)活性狀態(tài)，ROCKs是RhoA蛋白下游的信號分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，研究發(fā)現(xiàn)RhoA的作用主要是通過ROCK實現(xiàn)的[35]。ROCK 介導(dǎo)的信號通路可直接影響平滑肌細(xì)胞的收縮功能，激活的RhoA·GTP 在下游激活其靶目標(biāo)ROCK，后者與MLCP 的MYPT1 亞基結(jié)合，使其T850 和T696 位點發(fā)生磷酸化而失活，導(dǎo)致MLC的磷酸化水平增高，進(jìn)而增強平滑肌的收縮[33]。而cGMP-PKG途徑的PKG可直接抑制RhoA呈無活性的RhoA·GDP狀態(tài)，不能激活ROCK，而導(dǎo)致MLC脫磷酸，平滑肌舒張[36]。RhoA/ROCK 通路介導(dǎo)的平滑肌收縮目前在心血管疾病及糖尿病等中研究較多，而在GERD中的研究少見報道，這為我們研究NO介導(dǎo)的信號途徑在RE中的下游機(jī)制及靶點提供新思路。

3.3與其他通路的相關(guān)性柳剛[39]發(fā)現(xiàn)抑制p38 MAPK通路可以減少酸和胰蛋白刺激誘導(dǎo)的食管黏膜上皮細(xì)胞iNOS的表達(dá)上調(diào)和NO生成；Liying等[40]發(fā)現(xiàn)在RE向Barret食管進(jìn)展的過程中NO通過調(diào)節(jié)NF-кB水平產(chǎn)生一個自動調(diào)整作用，在低濃度NO時，NF-кB水平上升，上調(diào)iNOS表達(dá)，相反，在高濃度NO時，NF-кB水平和DNA結(jié)合活性被抑制，減少iNOS轉(zhuǎn)錄，顯示了NO濃度依賴的雙重性。目前MAPK途徑與NF-κB途徑對反流性食管炎食管組織中NO表達(dá)的影響方面的研究較少，其相關(guān)機(jī)制不是很明確，還需要進(jìn)一步的研究，是否還有其他途徑參與也尚不清楚。

4　存在問題及展望

長期以來，對于RE 的治療側(cè)重于抗酸治療，大多以質(zhì)子泵抑制劑為主，但其停藥后復(fù)發(fā)率高，且價格較昂貴，相對而言，中醫(yī)藥治療有不良反應(yīng)少、復(fù)發(fā)率低及價格低廉等特點。對NO與RE的相關(guān)機(jī)制及NO、NOS抑制劑的深入研究，將有助于RE的診治，但開發(fā)適合臨床的相關(guān)藥物并不多見，而已經(jīng)開發(fā)出的一些包括NOS抑制劑在內(nèi)的控制TLESR的藥物和NO供體劑由于存在毒副作用和口服效果差等方面的問題，加之NO發(fā)揮的雙重作用，目前未能廣泛使用。如何提高靶向性、專一性及降低毒副作用還有待于進(jìn)一步研究，這對我們祖國醫(yī)學(xué)是一個機(jī)遇也是一個挑戰(zhàn)，其研究空間及應(yīng)用前景較大。而目前中醫(yī)藥關(guān)于NO與RE的相關(guān)性有所研究，但具體機(jī)制并未闡明，是否有其他途徑參與尚不清楚。

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