羅格列酮對哮喘小鼠肺組織γ氨基丁酸A受體α亞單位及MUC5AC表達(dá)的影響研究

吳艷梅，柴雅琴，薛智文，張莉莉，呂建寧，杜小梅，張卓紅，張治國，張引亮，張栓寶

哮喘是一種慢性氣道炎性疾病，近年來隨著環(huán)境污染加重，其發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，目前全球約有3億人罹患哮喘，且每年約25萬患者死亡［1］。哮喘的主要病理表現(xiàn)為炎癥、氣道重建及氣道黏液過度分泌［2-3］。研究表明，哮喘發(fā)作時γ氨基丁酸（GABA）合成酶及γ氨基丁酸A受體α亞單位（GABAARα）參與氣道黏液的過度分泌［6］；MUC5AC由氣道杯狀細(xì)胞分泌，可反映氣道黏液分泌情況。糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘的首選藥物，但其不良反應(yīng)較多，故在臨床應(yīng)用受限。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）可調(diào)節(jié)糖類及脂類基因轉(zhuǎn)錄，與2型糖尿病、腎臟病、動脈粥樣硬化等慢性病發(fā)生有關(guān)，而羅格列酮是PPAR-γ激動劑，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用［4］。研究表明，PPAR-γ激動劑能抑制免疫因子合成及釋放，導(dǎo)致炎性遞質(zhì)減少，進(jìn)而減輕氣道炎癥［5］。本研究旨在探討羅格列酮對哮喘小鼠肺組織GABAARα及MUC5AC表達(dá)的影響，為哮喘早期治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2017年12月—2018年1月，50只健康雌性BABL/C小鼠由陜西中醫(yī)藥大學(xué)分子病理學(xué)實驗室提供，6～8周齡，平均體質(zhì)量（21.0±2.5）g。將所有小鼠隨機分為對照組、哮喘組、地塞米松組、羅格列酮組、聯(lián)合治療組，每組10只。

1.2 主要試劑 卵白蛋白（Sigma公司生產(chǎn)），氫氧化鋁（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)），地塞米松（辰欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)），羅格列酮（成都恒瑞制藥有限公司惠贈），小鼠抗GABAARα單克隆抗體、小鼠抗MUC5AC單克隆抗體（Abcam公司生產(chǎn)，ab33299），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生產(chǎn)）。

1.3 動物模型制備 實驗分為致敏、激發(fā)、取材3部分。（1）致敏：造模第1天和第8天，哮喘組、地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠腹腔注射卵白蛋白/氫氧化鋁混合液0.2 ml（含卵白蛋白 50 μg和氫氧化鋁35 mg）致敏；對照組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.2 ml。（2）激發(fā)：造模第15天，哮喘組、地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠給予卵白蛋白20 g/L霧化吸入30 min激發(fā)，1次/d，連續(xù)激發(fā)7 d，觀察小鼠呼吸及全身情況，以出現(xiàn)呼吸增快、打噴嚏、口周發(fā)紺、腹肌痙攣、點頭呼吸為激發(fā)成功；其中地塞米松組小鼠于霧化吸入卵白蛋白前30 min給予地塞米松1 mg/kg，羅格列酮組小鼠給予羅格列酮50 μmol/L霧化吸入，聯(lián)合治療組小鼠給予地塞米松（1 mg/kg）聯(lián)合羅格列酮（50 μmol/L）霧化吸入，對照組霧化吸入0.9%氯化鈉溶液。（3）取材：最后1次激發(fā)后24 h，采用5%水合氯醛400 mg/kg麻醉小鼠，取小鼠肺組織進(jìn)行檢測。

1.4 HE染色 每組各取5只小鼠左肺置于4%多聚甲醛固定24 h，固定結(jié)束后將肺組織切成1 cm×1 cm×0.2 cm組織塊，裝入組織盒，采用乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，制作成4 μm切片，采用蘇木素-伊紅染色（HE染色），觀察組織形態(tài)及炎性細(xì)胞浸潤情況。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法 每組各取5只小鼠左肺組織約30 mg，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒要求配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液，用去離子水稀釋待測蛋白樣品，取20 μl蛋白樣品加入BCA標(biāo)準(zhǔn)工作液200 μl混勻，37 ℃孵育30 min，采用酶標(biāo)儀（波長562 nm）測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度。

1.6 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 每組各取5只小鼠左肺組織約30 mg，研磨后加入Trizol 1 ml提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以2μl cDNA為模板行PCR，設(shè)定PCR參數(shù)，參照江剛等［7］實驗數(shù)據(jù)設(shè)置41 ℃水浴，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火1 min，反應(yīng)40個循環(huán)后再延伸95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。GABAARα引物序列為F：5'-CAACAGCTA TGGACTGGTTTATTG-3'，R：5'-GCATACCCTCTCTTG GTGAAA-3'，擴增長度100 bp；MUC5AC引物序列 為 F：5'-TGATGGCCTAGTTGTTGAGC-3'，R：5'-ATCTGGCGGAGCAGTTCTT-3'，擴增長度368 bp；參數(shù)GAPDH引物序列為F：5'-GGGTGTGAACCACGA GAAATA-3'，R：5'-GTCATGAGCCCTTCCACAAT-3'，擴增長度129 bp。PCR結(jié)束后，采用核酸蛋白測量儀檢測目的基因mRNA相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（x± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)表現(xiàn) HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠氣道黏膜上皮正常，氣道周圍無明顯炎性細(xì)胞浸潤；哮喘組小鼠氣道黏膜上皮局部脫落，黏膜下充血水腫，支氣管壁及血管壁周圍有較多炎性細(xì)胞浸潤；地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠上述表現(xiàn)較哮喘組減輕，見圖1。

2.2 肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度 各組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；哮喘組、地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度高于對照組，地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表1、圖2）。

圖2 5組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白電泳圖Figure 2 Protein electrophoresis results of GABAARα and MUC5AC in lung tissue in the five groups

2.3 肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA相對表達(dá)量 各組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；哮喘組、地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA相對表達(dá)量高于對照組，地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA相對表達(dá)量低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

表1 5組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度比較（x±s）Table 1 Comparison of protein concentration of GABAARα and MUC5AC in lung tissue in the five groups

3 討論

圖1 5組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE染色）Figure 1 Pathological features of lung tissue in the five groups

表2 5組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA相對表達(dá)量比較（x± s）Table 2 Comparison of mRNA relative expression quantity of GABAARα and MUC5AC in the five groups

哮喘是以氣流受限可逆為特征的慢性氣道炎性疾病，主要病理表現(xiàn)為氣道炎癥及氣道重塑。既往研究表明，哮喘黏液高分泌與氣道重塑有關(guān)，是哮喘氣道上皮杯狀細(xì)胞增生及黏膜下腺體肥大等病理生理變化結(jié)果［8］；哮喘發(fā)作時氣道黏液分泌增多，存在MUC5AC高表達(dá)［3，6，9］。氣道重塑是支氣管哮喘主要病理學(xué)特性，是導(dǎo)致氣道不可逆性氣流阻塞、重癥哮喘和致死性哮喘的主要病理基礎(chǔ)。GABA是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可引起氯離子通道開放，導(dǎo)致氯離子流向細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而引起神經(jīng)元膜發(fā)生超極化而抑制神經(jīng)元。既往研究表明，哮喘發(fā)作時γ氨基丁酸A受體（GABAAR）高表達(dá)、高分泌使纖毛柱狀上皮去極化狀態(tài)持續(xù)存在，并誘發(fā)纖毛柱狀上皮的杯狀上皮細(xì)胞化生，進(jìn)而引起氣道重建，故推測GABAAR可能參與哮喘的發(fā)生發(fā)展過程［10］。

目前，PPAR-γ配體已被證實在炎性疾病小鼠模型中具有抗炎活性，如關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、哮喘等［11］。PPAR-γ在肺組織中呈高表達(dá)，研究表明，PPAR-γ與激動劑結(jié)合后可抑制中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞功能，抑制氣道上皮細(xì)胞增生，減少哮喘發(fā)作時黏液分泌，減輕氣道炎性反應(yīng)，進(jìn)而抑制氣道重塑［12］。羅格列酮為PPAR-γ高選擇性激動劑，可抑制MUC5AC表達(dá)，減少氣道黏蛋白分泌［13-15］。

本研究結(jié)果顯示，哮喘組小鼠氣道黏膜上皮局部脫落，黏膜下充血水腫，支氣管壁及血管壁周圍有較多炎性細(xì)胞浸潤，提示哮喘組小鼠存在氣道炎癥及氣道重塑；而地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠上述表現(xiàn)較哮喘組減輕，提示羅格列酮存在抗炎及抑制氣道重塑等作用。本研究結(jié)果還顯示，哮喘組、地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度及其mRNA相對表達(dá)量高于對照組，地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度及其mRNA相對表達(dá)量低于哮喘組；而地塞米松組、羅格列酮組及聯(lián)合治療組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白濃度及其mRNA相對表達(dá)量間無差異，提示羅格列酮對哮喘小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC表達(dá)的影響與地塞米松及地塞米松聯(lián)合羅格列酮相當(dāng)，其可能通過下調(diào)GABAARα、MUC5AC表達(dá)而減少哮喘小鼠氣道黏液過度分泌。但本研究為動物實驗，且數(shù)量不足，羅格列酮治療哮喘的具體機制仍有待更多研究進(jìn)行探索。

作者貢獻(xiàn)：吳艷梅進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，對文章整體負(fù)責(zé)并監(jiān)督管理；柴雅琴、薛智文、張莉莉、呂建寧進(jìn)行研究的實施與可行性分析；杜小梅、張卓紅、張治國進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；張引亮、張栓寶進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；吳艷梅、柴雅琴負(fù)責(zé)撰寫論文；柴雅琴負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。