數(shù)字PCR技術(shù)及其在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

◎ 吳 冰，蔡先全，鄭傳發(fā)，邱 霞，蕭綺倩

（中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 中山 528403）

1999年，Kenneth Kinzler與Vogelstein B提出了“數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）”的概念[1]，該技術(shù)將DNA或RNA樣品分散成大量的微反應(yīng)單元，然后對(duì)眾多微反應(yīng)單元內(nèi)的靶序列進(jìn)行單分子模板PCR擴(kuò)增、熒光檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。該技術(shù)不依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)品，直接檢測(cè)樣品中核酸的原始濃度，比傳統(tǒng)熒光定量PCR的靈敏度和精確性更高。

1 數(shù)字PCR技術(shù)的基本原理

目前數(shù)字PCR主要分為3種：微孔式數(shù)字PCR、微滴式數(shù)字PCR和微腔式數(shù)字PCR。微孔式數(shù)字PCR是最早出現(xiàn)的數(shù)字PCR技術(shù)，在96或384孔聚丙烯板上完成；后來(lái)出現(xiàn)了微腔式數(shù)字PCR，采用了由多層軟刻蝕技術(shù)及聚二甲基硅材料制作成的系統(tǒng)；由于傳統(tǒng)的數(shù)字PCR技術(shù)取樣、操作復(fù)雜，成本較高；便衍生了微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，微滴式數(shù)字PCR是目前相對(duì)成熟的數(shù)字PCR平臺(tái)，利用油包水乳化微滴顆粒作為反應(yīng)器進(jìn)行檢測(cè)。目前，數(shù)字PCR儀主要有Bio-rad公司的QX100/QX200微滴式dPCR系統(tǒng)和RainDance公司的RainDropTM dPCR系統(tǒng)。

目前，應(yīng)用最廣泛的是微滴數(shù)字PCR，該技術(shù)具有靈敏度高、成本低的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)DNA的絕對(duì)定量。其工作原理是把DNA分子稀釋到一定濃度，生成一定數(shù)目的微滴，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，讀取陽(yáng)性微滴數(shù)目。再根據(jù)泊松分布計(jì)算出樣本中的DNA分子數(shù)[2-3]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，與熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR對(duì)核酸含量較低的樣品檢測(cè)準(zhǔn)確率和靈敏度都較高[4-8]。

2 數(shù)字PCR的優(yōu)勢(shì)

數(shù)字PCR技術(shù)是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。它將熒光定量PCR反應(yīng)體系分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個(gè)微反應(yīng)器中包含或不包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)核酸分子（DNA模板），在反應(yīng)器中進(jìn)行“單分子模板PCR擴(kuò)增”。擴(kuò)增結(jié)束后，檢測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)單元數(shù)目，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算原始樣本中靶基因的拷貝數(shù)。

數(shù)字PCR不依賴(lài)對(duì)照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)就可以進(jìn)行精確的絕對(duì)定量檢測(cè)。此外，由于數(shù)字PCR在判讀結(jié)果時(shí)，僅判斷“有/無(wú)”兩種擴(kuò)增狀態(tài)，因此熒光信號(hào)與設(shè)定閾值線(xiàn)的交點(diǎn)對(duì)其無(wú)影響，不依賴(lài)于Ct值。所以，數(shù)字PCR的讀數(shù)結(jié)果受擴(kuò)增效率的影響很低，對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高，數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過(guò)程可以極大地降低與目標(biāo)序列有競(jìng)爭(zhēng)性作用的背景序列濃度。因此，數(shù)字PCR技術(shù)特別適合檢測(cè)復(fù)雜背景中的稀有突變。

由于數(shù)字PCR具有靈敏度高、特異性好和精確性高的優(yōu)點(diǎn)，它在極微量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜背景下稀有突變檢測(cè)、表達(dá)量微小差異鑒定和拷貝數(shù)變異檢測(cè)等方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可，在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、單細(xì)胞基因表達(dá)和NGS測(cè)序文庫(kù)精確定量與結(jié)果驗(yàn)證等諸多方面具有廣闊研究前景。Kalorama Information發(fā)布的研究報(bào)告顯示，到2019年全球數(shù)字PCR市場(chǎng)預(yù)計(jì)將達(dá)39.7億美元，中國(guó)是最主要的新興市場(chǎng)[9]。

3 數(shù)字PCR在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

核酸擴(kuò)增技術(shù)是病原微生物檢測(cè)的一個(gè)重要方法，目前實(shí)驗(yàn)室主要采用基于Taq Man探針?lè)ǖ臒晒舛縋CR體系對(duì)病原微生物（病毒、細(xì)菌、支原體等）進(jìn)行核酸水平的檢測(cè)。雖然熒光定量PCR是目前病毒分子檢測(cè)方面的“金標(biāo)準(zhǔn)”，應(yīng)用廣泛，但依賴(lài)于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的Ct值，而用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)品缺乏統(tǒng)一的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)。而數(shù)字PCR則不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，因此，被科研人員大量應(yīng)用于病毒和致病菌的檢測(cè)研究中，如HBV[10-11]、腸病毒[12]、腺相關(guān)病毒[13]、巨細(xì)胞病毒[14]、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌[15]、結(jié)核分支杄菌[16]、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌[17]、沙門(mén)氏菌[18]、大腸桿菌O157:H7[19]等。

4 結(jié)語(yǔ)

數(shù)字PCR與傳統(tǒng)熒光定量PCR相比具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了單分子DNA絕對(duì)定量，能夠精準(zhǔn)分析出目標(biāo)基因的濃度，目前已成為分子生物學(xué)研究中的重要工具。

雖然目前數(shù)字PCR檢測(cè)多處于發(fā)展初期，大多還處于實(shí)驗(yàn)室的研發(fā)階段，沒(méi)有真正應(yīng)用到微生物定量檢測(cè)中。但是，該方法具有簡(jiǎn)單、快捷、靈敏、特異性強(qiáng)且綜合了熒光定量PCR的準(zhǔn)確性及基因芯片的高通量特點(diǎn)，并且不依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量，有望成為核酸絕對(duì)定量的新標(biāo)準(zhǔn)。今后，應(yīng)該將數(shù)字PCR法與現(xiàn)有的傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法相結(jié)合，制定微生物數(shù)字PCR檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，提高樣品中病原菌的檢出率，并推廣應(yīng)用，為微生物檢測(cè)提供技術(shù)支持。