紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系SCAR標(biāo)記的鑒定研究

周 仂， 王英哲， 譚 晶， 徐安凱，， 徐 博*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林 長春 130118； 2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 吉林 長春 130118)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是起源于伊朗的一種優(yōu)良牧草，也是我國種植面積最大的人工牧草。紫花苜蓿具有很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢，為利用好雜種優(yōu)勢，需建立一套準(zhǔn)確、高效的授粉控制系統(tǒng)，而雄性不育是紫花苜蓿利用雜種優(yōu)勢的重要途徑之一。近年來，紫花苜蓿雄性不育機(jī)理也受到越來越多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[1-4]。20世紀(jì)80年代，Kaul統(tǒng)計(jì)并發(fā)現(xiàn)雄性不育分為細(xì)胞核不育(Genic Male Sterility)和細(xì)胞質(zhì)不育(Cytoplasmic Male Sterility)，細(xì)胞質(zhì)不育也稱質(zhì)-核互作雄性不育[5]。細(xì)胞核不育雖然由單基因調(diào)控，但是無法得到保持系，所以在生產(chǎn)應(yīng)用中具有局限性。細(xì)胞質(zhì)不育的不育性雖然是由不育的細(xì)胞質(zhì)基因和相對應(yīng)的核基因共同決定，但相比細(xì)胞核不育它可以找到保持系，適應(yīng)于“三系”配套，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用上有廣闊的前景[6]。Robins J G等利用轉(zhuǎn)基因手段獲得了紫花苜蓿雄性不育株，揭示了其不育性的細(xì)胞學(xué)機(jī)理，并進(jìn)一步對其進(jìn)行了相應(yīng)的遺傳分析[7]。由于紫花苜蓿不育系和保持系在形態(tài)上無明顯差異，故無法通過形態(tài)學(xué)鑒定法在田間將二者區(qū)別開來，近年來隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)在紫花苜蓿不育機(jī)理研究中扮演著關(guān)鍵的角色。

近年來，簡單重復(fù)序列區(qū)域(Inter Simple Sequence Repeat，ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于植物的功能基因定位，遺傳多樣性分析等方面。ISSR標(biāo)記技術(shù)由Zietkiewicz等人于1994年所建立[8]，能產(chǎn)生豐富的多態(tài)性位點(diǎn)來揭示種間及種內(nèi)的遺傳差異[9]，操作簡單、快速、重復(fù)性好，屬顯性標(biāo)記，適合于系統(tǒng)學(xué)[10]、遺傳多樣性[11-12]、品種鑒定[13]、構(gòu)建遺傳圖譜[14-15]等研究。吳安迪等對在西南地區(qū)收集到105份材料進(jìn)行了核型分析和ISSR分析，篩選出了5條引物，結(jié)果顯示相同地理區(qū)域的材料在聚類分析中多聚為一類[16]。

隨著現(xiàn)代研究手段的進(jìn)步和理論研究的補(bǔ)充，AFLP、RAPD、RFLP、ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)都被應(yīng)用于雜交種純度鑒定研究中[17-20]，但這些分子標(biāo)記技術(shù)都存在不同的缺點(diǎn)。因此常將這些標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR[21]、STS[22]等標(biāo)記。1993年P(guān)aran和Michelmore發(fā)明并應(yīng)用SCAR標(biāo)記技術(shù)(Sequence Characterized Amplified Region)[23]。SCAR標(biāo)記即特異序列擴(kuò)增區(qū)，是以RAPD、RAGP、RFLP等分子標(biāo)記為基礎(chǔ)對目標(biāo)多態(tài)性DNA片段進(jìn)行克隆和測序，設(shè)計(jì)一段長為20 bp～24 bp的引物，再PCR擴(kuò)增。相比較RAPD、RGAP等標(biāo)記，SCAR標(biāo)記操作更簡單并且提高了分子標(biāo)記的重復(fù)性與穩(wěn)定性。王曉武等用RAPD標(biāo)記與BSA法結(jié)合研究獲得與甘藍(lán)顯性雄性不育基因Ms連鎖的1個RAPD標(biāo)記OT11900，并轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，為甘藍(lán)顯性雄性不育基因的輔助選擇提供了理論基礎(chǔ)[24]。陳沁濱等運(yùn)用RAPD技術(shù)對洋蔥雄性不育系101A和同型保持系101B的基因組DNA進(jìn)行研究分析，得到1個和洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因連鎖的特異片段AK151400，并將其成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，為不育基因分子標(biāo)記輔助選擇育種體系的建立奠定了基礎(chǔ)[25]。

盡管目前紫花苜蓿不育系的相關(guān)研究較多，但在紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)不育機(jī)理的研究方面仍存在一些問題。本研究中通過已獲得紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系材料和保持系材料，篩選與紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)不育恢復(fù)基因高度連鎖的分子標(biāo)記，并轉(zhuǎn)化SCAR標(biāo)記，對方便快捷鑒定不育系種子純度提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料 在紫花苜蓿雄性不育系材料MS-GN-1A及其保持系材料MS-GN-1B回交四代后選育出優(yōu)良的不育系及其保持系材料，取自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。將組配好的植物材料置于30℃下培養(yǎng)紫花苜蓿黃化苗7天，取樣品鮮樣1 g并提取各單株的植物線粒體DNA，構(gòu)建紫花苜蓿不育系和保持系混合基因池，用于其多態(tài)性分析。利用不育系材料MS-GN-1A與保持系材料MS-GN-1B篩選培育出新的4組紫花苜蓿雜交種的不育系母本和同型保持系父本MS-JN-1A，MS-JN-1B，MS-JN-2A，MS-JN-2B，MS-JN-3A，MS-JN-3B，MS-JN-4A，MS-JN-4B用于SCAR標(biāo)記的鑒定分析。

1.1.2引物 本試驗(yàn)所用的100條ISSR引物為加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第9套引物，由上海生工有限公司負(fù)責(zé)合成。

1.1.3試劑 采購由北京康為世紀(jì)生物公司生產(chǎn)編號為CW2619的質(zhì)粒提取試劑盒、2 × EsTaq酶;編號為EG101-2的DNA回收試劑盒、pEASYT1載體購自北京全試金生物公司。

1.2 方法

1.2.1提取線粒體和基因組 DNA在30℃下培養(yǎng)紫花苜蓿黃花苗7 d，取樣品鮮樣1 g根據(jù)試劑盒的提示提取線粒體DNA并用濃度為1.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測所提取的DNA質(zhì)量。

1.2.2ISSR-PCR擴(kuò)增 本試驗(yàn)所用的ISSR引物為加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第9套引物，由上海生工有限公司負(fù)責(zé)合成。經(jīng)過我們之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇針對紫花苜蓿線粒體DNA多態(tài)性好的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用20 μl體系，其中包括模板DNA 60 ng、dNTPs 0.4 mmol·L-1、引物0.6 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶 1.5 U和10×PCR Buffer 2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物在1.5 %瓊脂糖凝膠100 V電壓下電泳約2 h，在凝膠成像儀上拍照并保存。

1.2.3紫花苜蓿不育系和保持系特異片段的克隆及測序 按照凝膠回收試劑盒的步驟進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)的切膠回收工作，回收的片段經(jīng)檢測無誤后，連接到pEASY-T1克隆載體上，按照pEASY-T1 Cloning Kit說明書連接并轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)大腸桿菌，篩選陽性克隆。將陽性重組子培養(yǎng)后用質(zhì)粒提取試劑盒提取并鑒定。之后將陽性重組子的質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行序列測定，并通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。

1.2.4SCAR紫花苜蓿不育系和保持系 SCAR標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增檢測根據(jù)多態(tài)性片段的測序結(jié)果，設(shè)計(jì)PCR特異性引物，引物由上海生工有限責(zé)任公司合成，將ISSR-PCR特異性片段轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。根據(jù)設(shè)計(jì)引物的Tm值，確定其退火溫度。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸5min；4℃ 保存。以4對不育系和保持系線粒體基因組DNA為模板，用已設(shè)計(jì)的SCAR標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀拍攝照片并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿線粒體DNA的提取與分析

根據(jù)上述提取DNA的方法提取紫花苜蓿的線粒體DNA，通過共8份材料提取得到線粒體DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA質(zhì)量。結(jié)果如圖1所示，條帶整齊，顏色清澈透亮，提取的線粒體DNA滿足試驗(yàn)要求用于ISSR-PCR擴(kuò)增。

圖1 線粒體DNA電泳檢測Fig.1 Genomic DNA Electrophoresis Detection

2.2 紫花苜蓿不育系和保持系線粒體DNA的ISSR多態(tài)性分析

以本實(shí)驗(yàn)之前優(yōu)化的ISSR反應(yīng)體系與篩選的引物為基礎(chǔ)進(jìn)行ISSR分析，在圖2中可以看出，引物842和引物864的擴(kuò)增圖譜中，保持系分別比不育系多出1條特異性片段，經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，其差異條帶均穩(wěn)定出現(xiàn)，條帶大小都在500 bp左右?？梢猿醪脚袛?，這2個特異性片段都只在保持系中出現(xiàn)，表明這2個片段可能與紫花苜蓿的細(xì)胞質(zhì)不育基因相關(guān)。

圖2 不育系及與持系線粒體DNA部分ISSR引物篩選圖Fig.2 Mitochondrial DNA of sterile line and maintainerline screened by ISSR primers注：M：DNA標(biāo)準(zhǔn)；A：不育系；B：保持系Note:M:DNA Marker;A:sterile line;B:maintainer line

2.3 紫花苜蓿ISSR特異性條帶的測序和序列分析

將差異片段切膠并回收，連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，挑取陽性克隆搖菌并抽提質(zhì)粒，經(jīng)過M13F/R引物進(jìn)行鑒定，其結(jié)果顯示，2個特異性片段均已成功連接至pEASY-T1載體上，可用于后續(xù)進(jìn)行測序分析使用。

測序結(jié)果顯示2個片段的大小為457 bp和645 bp，將這2個序列利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blastn程序進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這2個序列存在于紫花苜蓿的線粒體DNA中，不編碼任何已知功能蛋白，但可用于不育系和保持系的鑒定和雜交種篩選。

2.4 SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化及鑒定

根據(jù)測序結(jié)果獲得的序列，設(shè)計(jì)一對特異性引物SCAR842-F(5’-GAGAGCCAAGCATCATTGATGGCG-3’)，SCAR842-R(5’-AGAGCTTGAGGGGTGGTGACCAT-3’)和SCAR864-F(5’-ATGATGGTGTAGTCAGGTTCAGTT-3’)，SCA R864-R(5’-ATGATGAACCGCTTACTCAACA-AGAA-3’)(圖3)。這2對特異性SCAR標(biāo)記在所有4個保持系中均穩(wěn)定擴(kuò)增出1條特異性條帶，大小均與目的片段相同(圖4，圖5)。表明已經(jīng)將ISSR-PCR分析中的多態(tài)性位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，可用于后續(xù)檢測和鑒定不育系和同型保持系和不育系種子的純度。

圖3 特異性片段序列信息Fig.3 The Sequence of Different DNA Bands

3 討論

在種類繁多的分子標(biāo)記中，SCAR標(biāo)記由于其優(yōu)越的穩(wěn)定、簡便、快速等性能脫穎而出，目前成為了分子標(biāo)記在輔助選擇育種、種子純度分析等育種實(shí)踐中能直接應(yīng)用的首選標(biāo)記。[26]。周生茂等通過集群分離分析法(BSA)與相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)(SRAP)獲得與苦瓜抗白粉病高度相關(guān)的SRAP標(biāo)記EM20ME5并轉(zhuǎn)化成為SCAR標(biāo)記SCRA-EM20ME5，該標(biāo)記可用于苦瓜抗白粉病的分子標(biāo)記輔助選擇[27]。張春寶等通過ISSR標(biāo)記方法獲得大豆不育系與相應(yīng)保持系間的特異片段ISSR829,并將其轉(zhuǎn)為SCAR標(biāo)記，可用于今后大豆不育系的篩選和不育系種子純度鑒定[28]。王仁漢等在已獲得洋蔥雄性不育基因連鎖的SCAR標(biāo)記OC2175的基礎(chǔ)上，對10份已知育性的洋蔥(5份不育系，5份保持系)和20份未知育性的洋蔥進(jìn)行提取DNA并PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)SCAR標(biāo)記OC2175可以區(qū)分洋蔥的不育系與保持系，初步驗(yàn)證了該標(biāo)記可用作于洋蔥雄性不育系材料的分子標(biāo)記輔助選擇[29]。Shu-Fen Li等在麥芽稈和麝香草種鑒定出17個雄性特異性擴(kuò)增片段，后經(jīng)BLAST技術(shù)分析得到7種與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子高度相關(guān)的連鎖序列并將其中2個轉(zhuǎn)化為SCAR-E52M11，SCAR-E54M11-2標(biāo)記，結(jié)果顯示這2個標(biāo)記可以有效地用于鑒定葎草的遺傳性、為進(jìn)一步研究性染色體的進(jìn)化提供研究基礎(chǔ)[30]。亞秀秀等將前人測序的11個與青海芥菜型油菜多室基因連鎖的AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，其中AFLP組合SA09MG08和SA10MC16被成功轉(zhuǎn)化，多態(tài)性良好，可利用該SCAR標(biāo)記對青海芥菜型油菜苗期多室與二室鑒定，顯著提高了育種效率[31]。畢波等運(yùn)用ISSR，AFLP和SRAP等技術(shù)對4個不同遺傳背景的紫花苜蓿進(jìn)行褐斑病抗性的適用性驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果顯示適用性高的標(biāo)記為感病標(biāo)記ISSR22S450、抗病標(biāo)記SRAPM3E3R169和ISSR20R750;適用性中等的標(biāo)記有感病標(biāo)記ISSR6S640和AFLP38S264,抗病標(biāo)記AFLP1R206,AFLP16R185和ISSR834R450;適用性差的標(biāo)記有感病標(biāo)記ISSR11S750和ISSR22S640[32]。已有研究表明，SCAR標(biāo)記在基因定位和分子標(biāo)記輔助育種中已經(jīng)開始普及，但在種子純度分析和不育系種子純度鑒定上卻鮮有報(bào)道，在紫花苜蓿中尚未見相關(guān)研究。

圖4 SCAR842對4對不育系和保持系進(jìn)行PCR檢測電泳圖Fig.4 Four pairs of male sterile lines and maintainerlines detected by SCAR842注：樣量：50 μL；濃度：50 ng·μL-1；M：DNA標(biāo)準(zhǔn)；1A～4A：新培育的4個保持系材料；1B～4B：新培育的4個不育系材料Note:Sample amount:50 μL;Concentration:50 ng·μL-1;M:DNA Marker; 1A～4A:4 newly maintained lineage materials;1B～4B:4 newly cultivated CMS materials

細(xì)胞質(zhì)雄性不育是指由細(xì)胞質(zhì)不育基因與細(xì)胞核不育基因共同調(diào)控的一種不育類型。大量研究表明，細(xì)胞質(zhì)雄性不育與線粒體基因組緊密相關(guān)，相比較而言與葉綠體基因組關(guān)系疏間[33]。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)引物842和引物864的擴(kuò)增圖譜中保持系分別比不育系多出1條特異性片段，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)序列存在于紫花苜蓿線粒體基因上。推斷可能由于這2個序列在紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中缺失，而與其對應(yīng)的保持系線粒體基因組中該片段正常，但是否此片段缺失造成不育系花粉敗育仍不能確定。

圖5 SCAR864對4對不育系和保持系進(jìn)行PCR檢測電泳圖Fig.5 Four pairs of male sterile lines and maintainerlines detected by SCAR864注：樣量：50 μL；濃度：50 ng·μL-1；M：DNA標(biāo)準(zhǔn)；1A～4A：新培育的4個保持系材料；1B～4B：新培育的4個不育系材料Note:Sample amount:50 μL;Concentration:50 ng·μL-1;M:DNA Marker;1A～4A:4 newly maintained lineage materials;1B～4B:4 newly cultivated CMS materials

4 結(jié)論

本研究用100條ISSR引物進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示UBC842、UBS864引物在紫花苜蓿不育系及其同型保持系顯示出穩(wěn)定特異性條帶，條帶大小分別為457 bp和645 bp。將特異性條帶克隆測序后轉(zhuǎn)化為SCAR特異鑒定標(biāo)記，并對4對紫花苜蓿雜交種的不育系母本和同型保持系父本進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記的重復(fù)性好，而且穩(wěn)定，表明該標(biāo)記可以作為紫花苜蓿不育系種子純度分析的候選標(biāo)記，實(shí)際應(yīng)用于紫花苜蓿不育系種子純度的鑒定，并且隨著紫花苜蓿參考基因組信息的補(bǔ)充，本研究中篩選出鑒定的SCAR標(biāo)記在紫花苜蓿雄性不育機(jī)理的研究中將會發(fā)揮越發(fā)重要的作用。