文心蘭不育花粉粒形態(tài)觀察及相關(guān)基因克隆與表達(dá)分析

高玉瑩,時(shí) 歡,王 云,陳 燕,賴鐘雄,葉開溫，2*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州 350002；2 臺(tái)灣大學(xué) 植物科學(xué)研究所，臺(tái)北 10617)

植物雄性不育是指雌雄同花植物中雄性器官由于受到種種內(nèi)在和外界因素的影響發(fā)育不全，花藥皺縮，花粉空癟，無法散粉的現(xiàn)象。植物雄性不育現(xiàn)象在自然界中普遍存在，據(jù)Kaul[1]統(tǒng)計(jì)，已在43個(gè)科162個(gè)屬320種植物中發(fā)現(xiàn)617例天然的或種間雜交來源的雄性不育，這個(gè)數(shù)字還在日益增加[2]。植物雄性不育促使植物發(fā)生雜交的幾率大大增加，能夠促進(jìn)植物有性生殖時(shí)遺傳物質(zhì)的重組，在植物物種進(jìn)化上有重要意義[3]。植物雄性不育是作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要途徑，因此對(duì)花藥及花粉發(fā)育的深入研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值[3]。細(xì)胞學(xué)研究是連接雄性不育分子水平和個(gè)體調(diào)控育性的重要環(huán)節(jié)[4]，其目的在于探討花粉發(fā)生敗育的時(shí)期和方式以及花粉敗育與花藥中間層、絨氈層細(xì)胞的異常行為的關(guān)系等[5]，對(duì)全面認(rèn)識(shí)植物花粉敗育機(jī)理有很大幫助[6]。Laser等[7]曾對(duì)多種細(xì)胞核雄性不育類型花粉敗育時(shí)期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)花粉敗育在造孢細(xì)胞(sporogenous cell，SC)至二核花粉各時(shí)期均有可能發(fā)生，其中有70% 的植物敗育時(shí)期發(fā)生在四分體以后。由于控制花粉或小孢子發(fā)育的基因各不相同，導(dǎo)致植物的敗育時(shí)期和方式也會(huì)因基因表達(dá)時(shí)期和作用機(jī)制的不同而各異[5]，將細(xì)胞學(xué)觀察與分子生物學(xué)研究相結(jié)合，有利于從整體上了解植物雄性不育的原因及機(jī)理。

越來越多的研究表明，一些轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控花藥發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，是功能性花粉形成的關(guān)鍵因子[8]。其中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子在花粉發(fā)育過程中起非常重要的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)已經(jīng)挖掘出很多與植物雄性不育相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，它們能通過各種形式調(diào)節(jié)花藥發(fā)育進(jìn)而影響植物育性[9]。整個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控中如果出現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)異常，不管過量表達(dá)還是基因沉默，都會(huì)影響花藥的正常發(fā)育，產(chǎn)生畸形、空癟的花粉，導(dǎo)致部分或完全雄性不育的發(fā)生[8]。如擬南芥的AtMYB103(之后稱為MYB80)能夠在絨氈層中特異表達(dá)，抑制該基因的表達(dá)能夠讓絨氈層的細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)提前，導(dǎo)致絨氈層無法完成正常的生理功能，而導(dǎo)致不育[10]；水稻中也發(fā)現(xiàn)了AtMYB103的直系同源基因OsMYB103，該基因的敲除導(dǎo)致絨氈層發(fā)育缺陷，成熟花藥中大多數(shù)小孢子缺乏外壁，植物育性降低[11]；擬南芥中AtMYB108突變體植物的花藥開裂延遲，花粉活力降低。與野生型相比，AtMYB108突變體植物的繁殖能力明顯下降，這些表型在MYB108MYB24雙突變體中都被加劇，并且雄蕊的花絲也明顯變短[12]?？傊?，MYB轉(zhuǎn)錄因子在花粉的發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用，涉及了花粉形成過程中各個(gè)關(guān)鍵步驟，包括絨氈層的代謝、花粉細(xì)胞壁的形成、單核小孢子的分化等[8]，研究MYB轉(zhuǎn)錄因子與花粉敗育的關(guān)系是研究植物雄性不育分子機(jī)制的主要方向。

文心蘭(Oncidiumspp)為蘭科文心蘭屬的植物，是熱帶和亞熱帶氣生蘭類?！畽幟示G’作為臺(tái)灣地區(qū)極受歡迎的文心蘭切花品種，具有花粉敗育和自交不親和特性。相關(guān)研究人員長期觀察發(fā)現(xiàn)，‘檸檬綠’在自然條件下無法進(jìn)行天然授粉而獲得果莢，并且經(jīng)多方努力進(jìn)行雜交試驗(yàn)，仍無法利用其育出新品種。本研究對(duì)文心蘭品種‘巧克力’(可育)和‘檸檬綠’(雄性不育)的花粉團(tuán)和花粉粒進(jìn)行對(duì)比研究，并對(duì)MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員OnMYB106基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，為進(jìn)一步探討‘檸檬綠’花粉敗育產(chǎn)生的原因及分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

文心蘭品種‘檸檬綠’(雄性不育)及‘巧克力’(可育)均由臺(tái)灣大學(xué)植物科學(xué)研究所提供。2018年4月取‘檸檬綠’和‘巧克力’的花粉團(tuán)和花粉粒置于固定液(酒精∶醋酸=3∶1)中保存?zhèn)溆茫蝗　畽幟示G’和‘巧克力’的花粉團(tuán)、‘檸檬綠’的不同組織部位(根、假鱗莖、上端葉、下端葉和花)及不同花期(花苞期、綻口期、半開放期、盛開前期、盛開期)的花為試驗(yàn)材料，在液氮中速凍后存于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1花粉團(tuán)的解剖顯微鏡觀察和掃描電鏡觀察于盛花期采集上述材料的花蕾(同一溫度處理)，用鑷子將采集后新鮮花蕾的花粉團(tuán)剝離下來于解剖顯微鏡下觀察，并選擇典型花粉團(tuán)拍照。同時(shí)，將‘巧克力’和‘檸檬綠’的部分花粉團(tuán)置于培養(yǎng)皿中，干燥處理約24 h后，將花粉團(tuán)粘于鋁金屬的膠膜上，經(jīng)過處理后噴金鍍膜(日立SCB Ⅱ離子濺射儀)，在掃描電子顯微鏡下(日立S-3400N)觀察花粉團(tuán)外觀形態(tài)、飽滿程度及表面紋飾并拍照。

1.2.2花粉粒的顯微觀察和掃描電鏡觀察從花梗抽出至花苞形成，分別采集上述材料的花粉，并浸入固定液(酒精∶醋酸=3∶1)中，10 h后在電子顯微鏡下觀察花粉粒的細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)，取上述材料的部分成熟花粉團(tuán)放于已加入少許雙蒸水的離心管中，靜置15 min，待花粉團(tuán)吸水脹破，低速離心，用移液槍吸取上清液于圓形的蓋玻片上，干燥處理10 h后，將圓形蓋玻片粘在鋁金屬臺(tái)上進(jìn)行噴金鍍膜(日立SCB Ⅱ離子濺射儀)，在掃描電子顯微鏡(日立S-3400N型)下觀察并拍照。

1.2.3‘檸檬綠’總RNA與基因組DNA提取采用Trizol up RNA試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司)提取‘檸檬綠’花器官總RNA。采用改良的CTAB法進(jìn)行‘檸檬綠’基因組DNA的提取。用超微量分光光度計(jì)(Thermo Electron Corp)檢測(cè)RNA及DNA樣品濃度，并用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量和純度。cDNA第一鏈的合成使用SMARTTMRACEA cDNA Amplification Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，具體操作見說明書。

1.2.4OnMYB106基因克隆以‘檸檬綠’轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中TR28980_c0_g1_i2的核酸序列作為克隆OnMYB106的參考序列，通過對(duì)序列進(jìn)行篩選、拼接，發(fā)現(xiàn)TR28980_c0_g1_i2具有完整的ORF序列。在TR28980_c0_g1_i2的ORF兩端設(shè)計(jì)拼接驗(yàn)證引物OnMYB106-ORF-F和OnMYB106-ORF-R(表1)，分別以‘檸檬綠’花器官的cDNA和gDNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用GSDS 2.0在線軟件將OnMYB106 的cDNA與gDNA序列進(jìn)行比對(duì)。試驗(yàn)中所使用的引物委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中cDNA模版1 μL，上下游引物各1 μL，Dream TaqTMGreen PCR Master Mix(2X) 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)后72 ℃繼續(xù)延伸5 min，并用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，將獲得的目的片段切膠回收，經(jīng)過TA克隆后挑選陽性克隆子送至鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.5生物信息學(xué)分析利用DNAMAN6.0軟件分析核苷酸序列；采用ExPASy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行翻譯蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)；利用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；通過NCBI Conserved Domain Search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；采用MEGA4.0軟件中的Neighbor-Joining(NJ)構(gòu)建MYB106蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，并利用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.2.6qRT-PCR分析根據(jù)已克隆的‘檸檬綠’OnMYB106的cDNA序列，利用DNAMAN6.0軟件設(shè)計(jì)特異引物q-OnMYB106-F和q-OnMYB106-R(表1)，以Actin為內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)在羅氏LightCycler 480儀器中進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR Ⅱ 10 μL，cDNA模版1 μL，上下引物各0.6 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40次循環(huán)。利用Excel軟件將所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，利用SPASS軟件進(jìn)行方差分析。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉團(tuán)形態(tài)觀察

‘巧克力’和‘檸檬綠’的花粉團(tuán)形態(tài)和大小無明顯差異，外觀形態(tài)都呈橢圓形(圖1)。相對(duì)來說，‘巧克力’花粉團(tuán)形態(tài)更加飽滿(圖1，B、C)，含有較多花粉；花粉團(tuán)的外觀結(jié)構(gòu)呈蜂巢狀，構(gòu)成花粉團(tuán)的單?；ǚ坌螒B(tài)飽滿、排列緊密(圖1，D)。而‘檸檬綠’的花粉團(tuán)形態(tài)比較干癟、皺縮(圖1，F(xiàn)、G)，花粉含量少；花粉團(tuán)表面不平整，由形狀不規(guī)則的花粉堆積而成，構(gòu)成花粉團(tuán)的單粒花粉形狀不規(guī)則，比較干癟(圖1，H)。

2.2 花粉粒形態(tài)觀察

‘巧克力’花粉細(xì)胞近圓形，大小規(guī)則，形狀正常(圖2，A、B)；‘檸檬綠’花粉細(xì)胞大小和形狀不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)高度液泡化(圖2，C、D)?！煽肆Α汀畽幟示G’花粉粒均比較小(10～25 μm)。其中，‘巧克力’花粉粒在未失水情況下近球形(圖3，A～C)，赤道面觀為圓形(圖3，A)，極面觀為三裂圓形(圖3，C)，具有三孔溝，外壁比較光滑無飾紋?！畽幟示G’成熟的花粉團(tuán)中無明顯花粉粒，在所觀察到的極少數(shù)花粉粒中包含長球形花粉粒(圖3，D、F)、極度變形的花粉粒(圖3，E、H)，長球形花粉粒的赤道面觀為稍寬的長橢圓形(圖3，D、F)，極面觀為三裂圓形(圖3，G)，未見到孔溝，花粉壁發(fā)育不連續(xù)，有很多孔洞(并非萌發(fā)孔；圖3，D～H)。

A、E分別為‘巧克力’和 ‘檸檬綠’花器官；B、C為‘巧克力’花粉團(tuán)；D為‘檸檬綠’花粉團(tuán)表面 形態(tài)的掃描電鏡圖；F、G為‘檸檬綠’花粉團(tuán)；H為‘檸檬綠’花粉團(tuán)的表面形態(tài)掃描電鏡圖圖1 花粉團(tuán)的解剖顯微觀察和掃描電鏡觀察結(jié)果 A, E represent Oncidium Sharry Baby and Oncidium Honey Angel flower, respectively; B，C represent Oncidium Sharry Baby pollen cluster; D represents SEM image of the pollen cluster surface morphology from Oncidium Sharry Baby; F，G represent Oncidium Honey Angel pollen cluste; H represents SEM image of the pollen cluster surface morphology from Oncidium Honey AngelFig.1 Observation of pollen cluster surface by dissecting microscope and scanning electronic microscopy

A、B為‘巧克力’花粉粒；C、D為‘檸檬綠’花粉粒；箭頭所指空泡化細(xì)胞圖2 花粉粒的顯微觀察結(jié)果 A，B represent Oncidium Sharry Baby pollen grains; C，D represent Oncidium Honey Angel pollen grains; Arrow denotes vacuolated cellsFig.2 Microscopic observation of pollen grains

A～C為‘巧克力’花粉粒；D～H為‘檸檬綠’花粉粒；箭頭所指萌發(fā)孔溝圖3 花粉粒的掃描電鏡觀察結(jié)果 A-C represent Oncidium Sharry Baby pollen grains; D-H represent Oncidium Honey Angel pollen grains; Arrow indicates the germination holesFig.3 Microscopic observation of pollen grains by scanning electron microscopy

2.3 OnMYB106基因克隆與生物信息學(xué)分析

以‘檸檬綠’花器官的cDNA為模板，進(jìn)行OnMYB106基因的PCR擴(kuò)增(圖4，A)。切膠、回收和測(cè)序結(jié)果顯示，‘檸檬綠’MYB106基因編碼區(qū)序列長819 bp，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中TR28980_c0_g1_i2的序列一致，將該基因命名為OnMYB106。以‘檸檬綠’花器官的DNA為模板，PCR擴(kuò)增OnMYB106的gDNA序列，擴(kuò)增獲得1 005 bp目標(biāo)條帶(圖4，B)。將OnMYB106基因的cDNA序列與gDNA序列進(jìn)行在線比對(duì)，結(jié)果顯示該基因含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子。

利用DNAMAN6.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，OnMYB106基因編碼區(qū)長819 bp，編碼272個(gè)氨基酸(圖5)。利用ExPASy ProtParam分析OnMYB106蛋白的理化性質(zhì)顯示，該蛋白分子式C1349H2130N398392S12，等電點(diǎn)9.70，屬于堿性蛋白。Signal P3.0 Server信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，OnMYB106不含信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。NCBI Conserved Domin Search鑒定結(jié)果顯示，OnMYB106屬于SANT 超家族，具有2個(gè)連續(xù)的MYB DNA-binding結(jié)構(gòu)域，為典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子(圖6)。

A. cDNA；B. gDNA;M. DL2000；箭頭所指目標(biāo)條帶圖4 OnMYB106基因的PCR擴(kuò)增 A. cDNA; B. gDNA;M. DL2000; Arrows show the target bandsFig.4 PCR amplification of OnMYB106

2.4 OnMYB106進(jìn)化樹分析與氨基酸序列比對(duì)

為驗(yàn)證‘檸檬綠’OnMYB106蛋白與其他植物MYB106蛋白的進(jìn)化關(guān)系，從NCBI中篩選出18個(gè)物種的MYB106蛋白序列，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)OnMYB106與高粱(XP_002444392.1)、水稻(LOC_Os08g33660.1)和二穗短柄草(XP_024316299.1)聚在同一分支，進(jìn)化上更為保守。將OnMYB106與其同一進(jìn)化分支上的同源基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)(圖8)，結(jié)果表明它們之間的相似性為70.68%，同源區(qū)域主要集中在N端R2R3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在C端保守性不高。

ATG為啟始密碼子；TAA為終止密碼子圖5 OnMYB106基因編碼序列和推測(cè)的氨基酸序列 ATG represents initiation codon; TAA represents stop codonFig.5 Coding sequence and deduced amino acid sequence of OnMYB106

圖6 OnMYB106保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.6 Prediction of OnMYB106 conserved domains

節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值表示Bootstrap重復(fù)1 000次的置信度，括號(hào)內(nèi)為蛋白登錄號(hào)圖7 不同植物中MYB106進(jìn)化樹分析 Numbers on branches indicate the percentage of 1 000 bootstrap replicates that support the adjacent node and the accession number of each protein is given in the bracketFig.7 Phylogenetic analysis of deduced amino acid sequences of MYB106 proteins from different plants

OnMY106. 文心蘭；OsMYB106. 水稻(LOC_Os08g33660.1)；BdMYB106. 二穗短柄草(XP_024316299.1)； SbMYB106. 高粱(XP_002444392.1)圖8 OnMYB106與其他物種MYB106氨基酸序列比對(duì) OnMYB106. O. hybridum; OsMYB106. Oryza sativa (LOC Os08g33660.1); BdMYB106. Brachypodium distachyon (XP 024316299.1); SbMYB106. Brachypodium distachyon (XP 024316299.1)Fig.8 Amino acid sequence alignment of OnMYB106 and MYB106s of other species

2.5 OnMYB106在‘檸檬綠’和‘巧克力’花粉團(tuán)中的表達(dá)分析

‘檸檬綠’和‘巧克力’同一組織(花粉團(tuán))中的定量結(jié)果表明(圖9)，OnMYB106在‘檸檬綠’中表達(dá)量極低(0.11)，‘巧克力’的表達(dá)量約是‘檸檬綠’的88倍，二者之間差異達(dá)到極顯著水平。

2.6 OnMYB106在‘檸檬綠’不同組織器官中的表達(dá)分析

以Actin為內(nèi)參基因，對(duì)‘檸檬綠’不同組織部位(根、假鱗莖、上端葉、下端葉、花)進(jìn)行了組織特異性分析。qRT-PCR結(jié)果表明(圖10)，OnMYB106在不同器官中均有表達(dá)，具有明顯的組織差異性；OnMYB106在花中的表達(dá)量最高，假鱗莖中的表達(dá)量最低，花中的表達(dá)量約為假鱗莖中的49倍，葉片和根表達(dá)次之；OnMYB106在花中的表達(dá)量與假鱗莖、根、葉片之間有顯著性差異(P< 0.05)，說明OnMYB106可能主要調(diào)控‘檸檬綠’花器官的生長發(fā)育。

不同小寫字母表示差異顯著P < 0.05，下同圖9 ‘檸檬綠’和‘巧克力’花粉團(tuán)的OnMYB106 基因表達(dá) Different letters mean significant difference at 0.05 level, the same as belowFig.9 Expression analysis of OnMYB106 gene in pollen clusters of Oncidium Honey Angel and Oncidium Sharry Baby

S1 ～ S5分別為‘檸檬綠’根、假鱗莖、上端葉、下端葉、花圖10 ‘檸檬綠’不同組織部位的OnMYB106基因表達(dá) S1-S5 represent roots, pseudobulb, upper leaves, bottom leaves and flower, respectivelyFig.10 Expression analysis of OnMYB106 gene in various tissues of Oncidium Honey Angel

F1 ～ F5分別為‘檸檬綠’花苞期、綻口期、 半開放期、盛開前期、盛開期圖11 ‘檸檬綠’不同花期的OnMYB106基因表達(dá) F1-F5 represent bud period, bud opening period, semi-open period, bloom prophase and blooming period, respectivelyFig.11 Expression analysis of OnMYB106 gene in different flowering stages of Oncidium Honey Angel

2.7 OnMYB106在‘檸檬綠’不同花期中的表達(dá)分析

‘檸檬綠’不同花期(花苞期、綻口期、半開放期、盛開前期、盛開期)的定量結(jié)果表明(圖11)，OnMYB106的表達(dá)具有明顯的時(shí)間特異性；從花苞期到盛開期，OnMYB106表達(dá)量基本成逐漸下降趨勢(shì)，花苞期的表達(dá)量最高，盛開期的表達(dá)量最低，花苞期的表達(dá)量約為盛開期的81倍；花苞期與另外4個(gè)時(shí)期的表達(dá)量均有顯著性差異。

3 討 論

3.1 ‘檸檬綠’花粉敗育特征分析

本研究通過將文心蘭品種‘巧克力’和‘檸檬綠’的花粉團(tuán)和花粉粒形態(tài)進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)‘檸檬綠’的花粉團(tuán)形態(tài)比較干癟、皺縮，花粉含量少；花粉細(xì)胞大小與形狀不規(guī)則，花粉內(nèi)含物缺失，細(xì)胞質(zhì)空泡化嚴(yán)重；花粉粒異常，花粉壁發(fā)育不連續(xù)，出現(xiàn)很多孔洞?；ǚ蹆?nèi)含物不僅對(duì)花粉壁的建構(gòu)起重要作用，其代謝產(chǎn)物還能為花粉壁的形成提供原料[13-14]。而花粉壁是花粉發(fā)育過程中相對(duì)獨(dú)立且最具特色的一部分，其發(fā)育異常是導(dǎo)致花粉不具備正常生物學(xué)功能的原因之一[15]。花粉壁主要起保護(hù)花粉細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整的作用，沒有花粉壁的包裹，花粉細(xì)胞內(nèi)含物會(huì)發(fā)生滲漏，從而引起花粉敗育[16]?！畽幟示G’花粉壁發(fā)育缺陷不僅會(huì)造成花粉皺縮塌陷[13, 17-18]，還可能與花粉內(nèi)含物的降解有關(guān)。此外，‘檸檬綠’花粉壁上的孔洞可能是一種細(xì)胞質(zhì)穿孔現(xiàn)象。相關(guān)研究證明，在不育植物中會(huì)經(jīng)?？吹交ǚ奂?xì)胞壁穿孔現(xiàn)象[19]，細(xì)胞質(zhì)穿壁會(huì)對(duì)花粉的發(fā)育帶來一系列不良后果，如導(dǎo)致花粉母細(xì)胞(PMC)中染色體的數(shù)目減少或增多，形成無核或雙核花粉粒，致使花粉粒大小不一致，最終產(chǎn)生無活力花粉?；蜻B體花粉粒，進(jìn)而引起花粉敗育[19]?！畽幟示G’花粉壁發(fā)育異常可能是導(dǎo)致其花粉敗育的一個(gè)主要原因。

3.2 ‘檸檬綠’OnMYB106蛋白特性分析

本研究以‘檸檬綠’為研究對(duì)象，在已知‘檸檬綠’轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得OnMYB106全長cDNA序列，序列分析表明OnMYB106屬于SANT 超家族，具有2個(gè)連續(xù)的MYB DNA-binding結(jié)構(gòu)域，為典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)化樹分析與氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，OnMYB106與高粱、水稻和二穗短柄草的MYB106蛋白處于同一進(jìn)化分支，這4個(gè)同源基因的氨基酸序列相似性高達(dá)70.68%，表明它們?cè)谶M(jìn)化上更為保守。陳利維等[20]的研究表明水稻的OsMYB106基因能夠調(diào)控花藥的發(fā)育，OsMYB106 RNAi轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出矮化及花粉敗育的現(xiàn)象，花粉壁發(fā)育相關(guān)基因OsMS2和CYP704B2在OsMYB106 RNAi轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)顯著下降，因此推測(cè)該基因可能通過調(diào)控OsMS2和CYP704B2的表達(dá)來影響花粉壁形成進(jìn)而影響花粉育性。并且相關(guān)研究證明，植物MYB轉(zhuǎn)錄因子主要通過調(diào)控絨氈層的發(fā)育、胼胝質(zhì)的降解和沉積、花粉細(xì)胞壁的形成、光合產(chǎn)物的運(yùn)輸以及雄配子體的形成來影響花粉的育性[20-23]。因此推測(cè)文心蘭OnMYB106可能與其同源基因OsMYB106功能相似，也屬于調(diào)控花粉壁發(fā)育來影響花粉育性的一類轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于此推測(cè)還需進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。

3.3 OnMYB106可能屬于調(diào)控花粉壁發(fā)育的一類轉(zhuǎn)錄因子

本研究的qPT-PCR結(jié)果表明，OnMYB106在‘巧克力’花粉團(tuán)中的表達(dá)量是‘檸檬綠’的88倍，二者之間差異達(dá)到極顯著水平。OnMYB106在花粉正常發(fā)育的‘巧克力’品種中超表達(dá)，說明該基因可能與花粉的正常發(fā)育有關(guān)。不同組織器官的定量結(jié)果顯示，OnMYB106在‘檸檬綠’花中的表達(dá)量最高，上端葉和下端葉次之，根和假鱗莖中表達(dá)量最低，花中的表達(dá)量與假鱗莖、根、葉片之間有顯著性差異(P< 0.05)，說明該基因可能對(duì)花的生長發(fā)育起重要的調(diào)控作用；結(jié)合不同花期的定量結(jié)果顯示，OnMYB106表達(dá)量變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，從花苞期到盛開期基本成逐漸下降趨勢(shì)，在花苞期顯著表達(dá)。Mascarenhas等[24]把花粉中的基因表達(dá)分為“早期”和“晚期”兩個(gè)階段。一般推測(cè)，“早期”基因主要用于編碼細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞壁合成蛋白或淀粉積累所需的蛋白；而“晚期”基因編碼的蛋白被認(rèn)為是花粉成熟或花粉管的發(fā)育所需要的[15]。OnMYB106在花苞期的表達(dá)量最高，此時(shí)花粉正處于發(fā)育早期，因此推測(cè)該基因?qū)儆诨ǚ郯l(fā)育“早期”表達(dá)基因，結(jié)合其同源基因OsMYB106的功能驗(yàn)證結(jié)果，初步推測(cè)OnMYB106主要影響‘檸檬綠’花粉壁的形成，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證明。后續(xù)可以借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)或其他方法抑制該基因在文心蘭可育品種中表達(dá)，進(jìn)一步確定該基因與花粉育性的關(guān)系。