鈣蛋白酶基因與畜禽肉質(zhì)相關(guān)性研究進(jìn)展

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(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000；2. 平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)檢驗(yàn)中心)

鈣蛋白酶系統(tǒng)是廣泛存在于脊椎動(dòng)物細(xì)胞中的一類半胱氨酸巰基內(nèi)肽酶，是一種主要依賴Ca2+激活的蛋白水解酶，主要由鈣蛋白酶(Calpain)、鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)及鈣蛋白酶激活蛋白組成。目前發(fā)現(xiàn)的鈣蛋白酶系統(tǒng)的同工酶有至少16種。廣泛存在的鈣蛋白酶根據(jù)其表現(xiàn)出半最高活性所需的Ca2+濃度的不同，主要分為兩種，其中一種是μ-calpain (calpain l)，激活其所需的Ca2+濃度為微摩爾級(jí)，另一種為m-Calpain(Calpain2)，激活其所需的Ca2+濃度為毫摩爾級(jí)。

1 鈣蛋白酶系統(tǒng)概述

鈣蛋白酶最早是1964年由Gurof等在大鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)并分離鑒定出的。后來(lái)，又先后從心肌、肝臟等組織中提取獲得鈣蛋白酶。1976年Daytion等人對(duì)該酶進(jìn)行了分離純化。1981年被命名為EC3.4.22.17，即鈣蛋白酶或鈣激活蛋白酶。1984年Ohno等第一次克隆出了該酶的cDNA 。1991年，該酶被正式命名為鈣蛋白酶(Calpains)。

1.1 鈣蛋白酶的結(jié)構(gòu)

根據(jù)鈣蛋白酶各同工酶所具有的不同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將其分為典型鈣蛋白酶和非典型鈣蛋白酶兩種。典型鈣蛋白酶由80 kD大亞基和30 kD小亞基組成，大亞基分為四個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，小亞基由Ⅴ和Ⅵ兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。結(jié)構(gòu)域Ⅰ位于N端，可以和30 kD的小亞基形成二聚體，起到活性調(diào)節(jié)作用；結(jié)構(gòu)域Ⅱ是鈣蛋白酶的核心結(jié)構(gòu)域，在該區(qū)域存在由 Cys-His-Asn 肽殘基構(gòu)成的催化區(qū)域，是鈣蛋白酶表現(xiàn)其水解活性的關(guān)鍵位置；結(jié)構(gòu)域Ⅲ是鈣蛋白酶的活性調(diào)節(jié)區(qū)域；結(jié)構(gòu)域Ⅳ包含了5個(gè)鈣蛋白酶所特有的EF-hand結(jié)構(gòu)。典型鈣蛋白酶包括Calpain 1、2、3、8、9、11、12和13，其中Caipain 1、2和9能與30 kD的小亞基形成異源二聚體，而Calpain3、8、12盡管含有結(jié)構(gòu)域Ⅳ，卻不能與30 kDa小亞基相互作用。非典型鈣蛋白酶包括Calpain5、6、7、8b、10a和15，這類鈣蛋白酶沒(méi)有結(jié)構(gòu)域Ⅳ，且其它3個(gè)結(jié)構(gòu)域存在缺失或者替換，不能與小亞基形成二聚體。

1.2 鈣蛋白酶功能及其作用機(jī)理

研究表明鈣蛋白酶在宰后肌肉嫩化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是影響肌肉嫩度的基本酶類。但不是鈣蛋白酶的所有成員都對(duì)肌肉的嫩化過(guò)程起作用，有研究顯示，在肌肉嫩化的過(guò)程中，m-calpain的活性幾乎保持不變，而μ-calpain的活性顯著下〗。而鈣蛋白酶活性下降是其發(fā)揮水解作用的體現(xiàn)，因此人們廣泛認(rèn)為是μ-calpain參與肌肉的嫩化，而m-calpain并不參與這一過(guò)程。

動(dòng)物機(jī)體中的Ca2+在正常狀態(tài)下主要存在于肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的 Ca2+的濃度約是10～7mol/L。屠宰后的肌肉在冷卻時(shí)會(huì)受到刺激，肌質(zhì)網(wǎng)則失去保護(hù)Ca2+的能力，從而Ca2+被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致肌纖維細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離的 Ca2+濃度升高到大于10～6 mol/L。因而使Calpain被激活，并且開(kāi)始降解肌纖維蛋白，使肌纖維的Z盤崩解，肌原纖維破碎，進(jìn)而使肌肉嫩度增加。

1.3 鈣蛋白酶活性調(diào)節(jié)

鈣蛋白酶活性的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，主要包括Ca2+濃度的正調(diào)控和鈣蛋白酶抑制蛋白的負(fù)調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高后，Ca2+與鈣蛋白酶的EF-hand結(jié)構(gòu)結(jié)合，隨后Calpain的大小亞基分離，發(fā)生自溶現(xiàn)象，構(gòu)像發(fā)生變化，暴露出具有催化活性的半胱氨酸三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，從而表現(xiàn)出鈣蛋白酶的水解活性。但只有當(dāng)鈣離子濃度高于2μmol/L時(shí)鈣蛋白酶才會(huì)被激活，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度一般為0.2～0.8μmol/L，所以一般情況下鈣蛋白酶處于未激活狀態(tài)。在動(dòng)物屠宰后，肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣離子釋放，鈣離子濃度顯著升高，激活了鈣蛋白酶，促進(jìn)動(dòng)物屠宰后肌肉的成熟嫩化。

鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)則是專一性的鈣蛋白酶活性的抑制蛋白。CAST與Calpain結(jié)合的過(guò)程是可逆的，這個(gè)過(guò)程同樣也要依賴Ca2+的參與完成。正常情況下Calpain主要在細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高后，Ca2+則會(huì)和Calpain結(jié)合并使其表現(xiàn)對(duì)底物水解作用，這時(shí)CAST就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合Calpain，導(dǎo)致Calpain的活性降低，從而防止了Calpain對(duì)細(xì)胞的破壞；繼續(xù)提高Ca2+濃度，此時(shí)Calpain才會(huì)表現(xiàn)其蛋白酶水解活性。除此之外，鈣蛋白酶的活性還受離子強(qiáng)度、pH及底物蛋白磷酸化等因素影響。

2 鈣蛋白酶基因

2.1 CAPN1基因

CAPN1是鈣蛋白酶基因家族研究最多的成員之一，在肌原纖維蛋白降解中起著重要的作用，與肌肉增長(zhǎng)和宰后嫩度的變化及蛋白質(zhì)水解程度密切相關(guān)。目前已克隆了人、猴、大鼠、小鼠、雞、豬、兔、牛和牦牛的CAPN1基因的cDNA序列，不同物種的基因序列的結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度差異較大。據(jù)GenBank上公布的序列，人的CAPN1基因位于11號(hào)染色體上，由22個(gè)外顯子和21個(gè)內(nèi)含子組成；雞的CAPN1基因位于3號(hào)染色體上，由21個(gè)外顯子和20個(gè)內(nèi)含子組成；小鼠CAPN1基因全長(zhǎng)21 kb，含有28個(gè)外顯子；牛的CAPN1基因位于29號(hào)染色體，該基因的mRNA序列長(zhǎng)為26517 bp，由22個(gè)外顯子和21個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，內(nèi)含子遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外顯子。

2.2 CAPN2基因

由于大多數(shù)的研究認(rèn)為CAPN2基因不參與肌肉嫩化的過(guò)程，因此對(duì)該基因的研究相對(duì)較少。人的CAPN2基因位于1號(hào)染色體上，mRNA長(zhǎng)度為3 270 bp，由21個(gè)外顯子和20個(gè)內(nèi)含子組成；雞的CAPN2基因位于3號(hào)染色體上，rnRNA序列長(zhǎng)為2 723 bp(NM 2050801)，由21個(gè)外顯子和20個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成；牛的CAPN2基因位于16號(hào)染色體上，mRNA長(zhǎng)度為3 207 bp；劉仲娜等通過(guò)電子克隆技術(shù)與序列分析，得到牦牛的CAPN2基因cDNA全長(zhǎng)為3 200 bp，包含一個(gè)2 103 bp的開(kāi)放閱讀框，共編碼700個(gè)氨基酸。牦牛 CAPN2 的核苷酸序列與普通牛、羊、馬、豬、小鼠、雞、人相應(yīng)序列間的一致性分別為99%、97%、90%、87%、85%、79%、90%。

2.3 CAPN3基因

CAPN3也是鈣蛋白酶家族中的一個(gè)成員，有 CAPN3a(p94)和CAPN3b(LP82)兩個(gè)變異剪接體，CAPN3a 有24個(gè)外顯子，4個(gè)結(jié)構(gòu)域，全長(zhǎng)約50kb，分子量為94 kD。CAPN3a通過(guò)可變剪切去掉外顯子6、15和16，并且采用不同的核苷酸序列作為外顯子1，就形成了CAPN3b。人類CAPN3蛋白氨基序列與CAPN1的同源性為51%，與CAPN2的同源性為54%。骨骼肌特異性蛋白酶只在骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)量是普通鈣蛋白酶的好幾倍，呈現(xiàn)出高度的表達(dá)特異性。目前關(guān)于CAPN3 基因的研究，主要集中在CAPN3基因的克隆、多態(tài)性分析、基因表達(dá)差異以及與牛、羊、豬、及雞、鴨等物種肉質(zhì)及胴體重相關(guān)性的分析上，同時(shí)在其與人類疾病的相關(guān)性研究中也取得了一定的進(jìn)展。人類CAPN3基因定位于15號(hào)染色體上，基因組大約138 kb。mRNA 長(zhǎng)度為3 316 bp，由24個(gè)外顯子組成。普通牛CAPN3 基因位于第10號(hào)染色體。Ilian等研究發(fā)現(xiàn) CAPN3蛋白表達(dá)水平與肉的嫩度存在顯著相關(guān)性，在綿羊上CAPN3蛋白水平和mRNA水平與嫩度具有高相關(guān)性。因此，CAPN3基因也可以作為嫩度性狀的一個(gè)候選基因。

3 鈣蛋白酶1(CAPN1)基因與肉質(zhì)相關(guān)性的研究

目前，CAPN1基因作為肉質(zhì)性狀的候選基因報(bào)道較多，并逐漸應(yīng)用于肉品嫩度性狀的標(biāo)記輔助選擇。Susan Castro等研究了CAPN1基因與牛肉色的相關(guān)性，結(jié)果表明，CAPN1基因與肌肉的肉色值沒(méi)有顯著相關(guān)性，但作者認(rèn)為該基因仍可以作為研究肉色性狀的一個(gè)候選基因。也有大量研究報(bào)道CAPN1基因與畜禽宰后肌肉成熟嫩化相關(guān)。Casas等將影響牛肉嫩度的QTL定位于14和29號(hào)染色體，并在CAPN1基因中檢測(cè)到316 bp、4 753 bp和5 331 bp的SNPs突變位點(diǎn)，隨后又在瘤牛中發(fā)現(xiàn)同樣的3個(gè)SNP突變位點(diǎn)，表明CAPN1基因316位點(diǎn)突變與嫩度存在顯著相關(guān)。Iglesias等采用ARMS-PCR和PCR-RFLP方法對(duì)Hereford牛，Brahman牛和 Braford牛群體進(jìn)行研究后在內(nèi)含子17上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)插入/刪除突變，認(rèn)為該突變是一個(gè)非常有價(jià)值的與肉質(zhì)相關(guān)的候選基因，并可以幫助解決熱帶地區(qū)舍飼牛的肌肉嫩度問(wèn)題。Hoyoung Chung等研究表明，CAPN1基因的三個(gè)遺傳標(biāo)記與牛肉剪切力顯著相關(guān)，并對(duì)剪切力有顯著的累加效應(yīng)，因此可以作為研究肉質(zhì)嫩度的一個(gè)候選基因。陸克龍采用PCR-SSCP的方法對(duì)靈山土雞CAPN1基因外顯子5進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn)，4種不同的基因型，不同基因型在剪切力、肌內(nèi)脂肪含量上存在差異。束婧婷等在清遠(yuǎn)麻雞和隱性白羽肉雞CAPN1基因外顯子5和外顯子6中檢測(cè)到3個(gè)突變位點(diǎn)，且隱性白羽肉雞中不同基因型個(gè)體的剪切力和系水力之間存在顯著差異，因此認(rèn)為該基因的SNPs影響肌肉的剪切力和系水力等性狀，說(shuō)明該基因可能是影響雞的肌肉嫩度的主效基因連鎖。

也有研究表明CAPN1基因突變除影響屠宰后肌肉嫩度外，也與其他胴體及肉質(zhì)性狀相關(guān)，武秀香等采用PCR-SSCP檢測(cè)到雷瓊牛、BMY牛、中國(guó)西門塔爾牛和云南高峰牛CAPN1基因兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)A4558G和C4684T，其中A4558G突變與胴體產(chǎn)肉率、骨重和肉骨比顯著相關(guān)，C4685T突變對(duì)宰前活重、胴體重、凈肉重、網(wǎng)膜油重及腸系膜油重性狀效應(yīng)顯著；張彩霞等在早勝牛CAPN1基因第9外顯子檢測(cè)到G458C突變位點(diǎn)，形成GG、GC和CC 3種基因型，該位點(diǎn)與剪切力值、pH和滴水損失存在顯著相關(guān)，CC基因型個(gè)體剪切力值和滴水損失顯著低于GG和GC基因型個(gè)體。Xin L〗等在5個(gè)品種牛中檢測(cè)到CAPN1基因的一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)CAPN1:c947，包含CC、CG和GG三種基因型。該多態(tài)位點(diǎn)與宰后6 days的肉色hue值、肌內(nèi)脂肪含量和大理石紋評(píng)分顯著相關(guān)，且CG基因型個(gè)體的肉色hue值高于其余兩種純合子的，肌內(nèi)脂肪含量和大理石紋評(píng)分為CC基因型個(gè)體的高于CG基因型和GG基因型個(gè)體的。

4 總結(jié)

鈣蛋白酶是一種蛋白水解酶，不僅在調(diào)節(jié)宰后畜禽肉質(zhì)嫩度方面發(fā)揮重要作用，而且通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架蛋白、磷酸酶和蛋白激酶的作用，參與肌肉生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖與分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程。同時(shí)，鈣蛋白酶系統(tǒng)因參與機(jī)體生長(zhǎng)、代謝以及肌原纖維更新的過(guò)程而與一些疾病密切相關(guān)，但針對(duì)具體疾病的相關(guān)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。