中醫(yī)藥對(duì)Dll4-Notch信號(hào)通路及血管再生影響的研究*

何志軍，姚興璋，李盛華，趙 萍，蔣振興

甘肅省中醫(yī)院/甘肅省隴中正骨醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

Notch基因最早在果蠅體內(nèi)被證實(shí)，隨后的研究發(fā)現(xiàn)Notch在無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物的多個(gè)物種內(nèi)均有表達(dá)，包括調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、分化和增殖［1］。Dll4-Notch是一條進(jìn)化保守的信號(hào)傳遞途經(jīng)，由細(xì)胞膜上表達(dá)的Notch受體、Notch配體及下游信號(hào)分子組成。Notch的配體又稱作DSL蛋白，目前已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的5種Notch配體分別稱為Delta like1(DLL1)、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged2。Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的啟動(dòng)依賴于相鄰細(xì)胞間受體與配體的相互作用，這種相互作用激活了Notch受體的2次酶切事件［2］。

1 Dll4-Notch信號(hào)通路與血管再生

血管再生是指從原有的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、游走，形成新的血管網(wǎng)，并在原來(lái)存在的血管結(jié)構(gòu)上長(zhǎng)出新血管的生物學(xué)過(guò)程。血管再生在組織損傷修復(fù)、缺血性心腦血管疾病及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。血管再生過(guò)程依賴促血管發(fā)生因子和抗血管發(fā)生因子調(diào)控。正常人體內(nèi)有多種抗血管發(fā)生因子，可抑制血管生成；然而，當(dāng)組織成長(zhǎng)和生存依賴血液持續(xù)地供給氧氣和營(yíng)養(yǎng)時(shí)，在胚胎發(fā)育、女性月經(jīng)周期、懷孕和傷口修補(bǔ)等過(guò)程中，抗血管發(fā)生因子減少，促血管發(fā)生因子增加，從而誘導(dǎo)血管生成。若血管生成的調(diào)控出現(xiàn)問(wèn)題，可導(dǎo)致各種疾病(包括惡性腫瘤)的發(fā)生。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的促血管再生的細(xì)胞因子，具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、促血管生成、延長(zhǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞壽命、提高血管通透性等生物學(xué)作用［3-4］。內(nèi)皮細(xì)胞被劃分為兩類細(xì)胞：頂端細(xì)胞(Tip cell)和柄細(xì)胞(Stalk cell)。血管再生的過(guò)程為：1)在特定位置誘導(dǎo)并選擇頂端細(xì)胞的形成；2)頂端細(xì)胞的絲足沿著促血管生長(zhǎng)因子分泌充足的地方遷移；3)柄細(xì)胞在血管芽延伸的時(shí)候增殖。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路在內(nèi)皮細(xì)胞特化為頂端細(xì)胞和柄細(xì)胞的過(guò)程中起到重要調(diào)控作用［5］。Notch在柄細(xì)胞中的活性很高，而在頂端細(xì)胞中呈低水平表達(dá)；相反，Dll4在頂端細(xì)胞中表達(dá)較高。作為血管形成正向調(diào)節(jié)因子的VEGF，通過(guò)誘導(dǎo)VEGFA的表達(dá)而啟動(dòng)Dll4/Notch信號(hào)作為負(fù)反饋調(diào)節(jié)因素，有效預(yù)防過(guò)量血管的形成，從而促進(jìn)了一個(gè)分化良好的血管網(wǎng)能夠根據(jù)環(huán)境的需要而及時(shí)形成。其具體機(jī)制為VEGFA通過(guò)與VEGFR2結(jié)合刺激并誘導(dǎo)內(nèi)皮頂端細(xì)胞表達(dá)Dll4，Dll4與鄰近柄細(xì)胞內(nèi)的Notch信號(hào)結(jié)合，通過(guò)下調(diào)VEGFR2和VEGFR1上調(diào)的表達(dá)水平，抑制頂端細(xì)胞表型以促進(jìn)柄細(xì)胞特化，使二者之間保持在一個(gè)合適的比例以確保血管出芽的精確性［6］?？梢?jiàn)，VEGF是Dll4的正向調(diào)節(jié)因素，而Dll4是VEGF信號(hào)的負(fù)向調(diào)節(jié)因素［7］。2006 年，Noguera-Troise等［8］提出了將阻斷Dll4-Notch信號(hào)作為治療癌癥的新方法，引起了研究者對(duì)于Dll4-Notch信號(hào)傳遞系統(tǒng)治療腫瘤的關(guān)注。腫瘤的生長(zhǎng)以往被認(rèn)為與腫瘤微血管密度MVD呈正相關(guān)，即血管生成越多、腫瘤進(jìn)展越快，因此，常規(guī)抗腫瘤血管生成的治療策略主要是阻止促血管生成因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞。近年來(lái)，VEGF阻斷劑方面的研究認(rèn)為，阻斷劑僅能減少腫瘤中“小血管”的數(shù)量，對(duì)“大血管”無(wú)影響。由于“大血管”的形態(tài)與功能更完好且管腔較大，能夠?yàn)槟[瘤傳遞營(yíng)養(yǎng)和氧氣，增加腫瘤血供，從而改善腫瘤內(nèi)部的低氧環(huán)境并減少壞死區(qū)域。而阻斷Notch信號(hào)，能破壞“大血管”的形成，加重缺氧程度的同時(shí)大幅度上調(diào)VEGF的表達(dá)水平，能夠提高VEGF阻斷劑療效。相比于單藥治療，同時(shí)靶向Dll4和VEGF能產(chǎn)生抗腫瘤協(xié)同效應(yīng)。

2 中醫(yī)藥對(duì)Notch信號(hào)通路影響的研究

目前，中醫(yī)藥在抗腫瘤血管生成領(lǐng)域取得了不少成果，但其機(jī)制研究仍主要集中在對(duì)腫瘤血管生成過(guò)程中主要調(diào)控因子(如VEGF等)的影響。中藥對(duì)Dll4介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路影響的作用機(jī)制研究較少。苗學(xué)紅等［9］采用補(bǔ)腎疏肝方治療晚期非小細(xì)胞肺癌患者，可縮小病灶，提高機(jī)體免疫功能，改善生存質(zhì)量，其機(jī)理為補(bǔ)腎疏肝方誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，也可能與抑制Notch1、Delta4、VEGF基因表達(dá)有關(guān)。劉少瓊等［10］探討了姜黃素抑制大腸癌細(xì)胞增殖的分子基礎(chǔ)可能是通過(guò)Notch信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，認(rèn)為姜黃素可抑制Notch信號(hào)通路中Notch受體和Jagged配體蛋白表達(dá)、抑制γ-分泌酶、抑制Notch信號(hào)下游的靶基因Skp2及影響與其相關(guān)的其他通路，最終達(dá)到抑制大腸癌增殖與轉(zhuǎn)移的目的。有研究［11］認(rèn)為，養(yǎng)肺活血方能顯著改善肺纖維化大鼠的肺泡炎和肺纖維化程度，有效防治肺纖維化。其作用機(jī)制與下調(diào)Notch1、NICD1、Notch4、Jagged1、Dll4 的 表 達(dá) 有關(guān)，提示該方可通過(guò)干預(yù)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)防治肺纖維化。楊丹丹等［12］研究認(rèn)為，血塞通能夠通過(guò)促進(jìn)MSCs表達(dá)、抑制VEGF/Notch信號(hào)通路改善大鼠心臟功能、減小病理改變程度，促進(jìn)心肌損傷修復(fù)，具有一定的心肌保護(hù)作用。作為抗腫瘤血管生成的新靶點(diǎn)，Notch與VEGF信號(hào)通路在腫瘤血管生成過(guò)程中各自發(fā)揮的重要作用好比于“陰陽(yáng)”兩面，兩者之間相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)控腫瘤血管生成。雖然中醫(yī)藥對(duì)腫瘤血管再生及干預(yù)腫瘤增值與轉(zhuǎn)移方面取得了一些進(jìn)步，但這大多集中在抑制血管生成方面，而通過(guò)介導(dǎo)Dll4-Notch信號(hào)通路促進(jìn)血管生成在顯微外科方面的應(yīng)用卻未見(jiàn)報(bào)道。

3 中醫(yī)藥對(duì)血管再生影響的研究

除心腦血管領(lǐng)域注重血管再生問(wèn)題的研究，顯微外科、整形外科同樣重視血管再生。為保證術(shù)后修復(fù)組織的成活率，很多修復(fù)手術(shù)完成的質(zhì)量很高，但組織新生或修復(fù)愈后結(jié)果并不理想，如復(fù)合骨皮瓣修復(fù)術(shù)后，血循環(huán)障礙致皮瓣成活質(zhì)量低或骨瓣不愈合。這些問(wèn)題的核心在于如何促進(jìn)組織血管再生。臨床中很少有人將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與顯微外科領(lǐng)域聯(lián)系在一起。隨著中醫(yī)藥在腦血管、心血管方面研究的不斷深入［13-14］，顯微外科工作者也將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢(shì)發(fā)揮在顯微外科血管再生方面。近年來(lái)，單味、復(fù)方中藥或其有效成分提取物在顯微外科術(shù)后促進(jìn)神經(jīng)、血管、骨骼、肌腱、皮膚等組織修復(fù)中的應(yīng)用研究廣泛開(kāi)展［15］；周昭輝等［16］應(yīng)用桃紅四物湯對(duì)大鼠隨意皮瓣的干預(yù)研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯能明顯促進(jìn)大鼠隨意皮瓣的成活，提高皮瓣下新生微血管數(shù)量，并促進(jìn)大鼠VEGF的表達(dá)。祛瘀生新是中醫(yī)學(xué)中重要的治法治則，歷代醫(yī)學(xué)典籍中對(duì)這一領(lǐng)域均有詳細(xì)論述。但大多集中在理法方藥方面的研究，沒(méi)有直觀的理解和解釋。隨著對(duì)理論體系的完善，近年來(lái)對(duì)本領(lǐng)域的研究由功能性的“祛瘀化瘀活血”逐漸過(guò)渡到嘗試揭開(kāi)祛瘀后疾病好轉(zhuǎn)、治愈的內(nèi)在原因?！把觥钡母拍钪饾u深入到創(chuàng)傷骨科及顯微外科中。中醫(yī)外科通過(guò)手術(shù)祛腐以促進(jìn)正常組織新生的手段其寶貴經(jīng)驗(yàn)中重要的一環(huán)就是手術(shù)本身就是“祛瘀”的手段之一，其手術(shù)的作用就是“祛瘀”，而手術(shù)的目的在于更深層次的“生新”。由此可見(jiàn)，祛瘀生新與顯微外科治療理念相符合，旨在促進(jìn)術(shù)后組織的新生。相關(guān)研究［17-18］通過(guò)建立動(dòng)物血管修復(fù)模型，觀察基于祛瘀生新治則指導(dǎo)下復(fù)元活血湯劑對(duì)血管、神經(jīng)顯微外科修復(fù)術(shù)后各相關(guān)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、血液生化、相關(guān)蛋白或基因表達(dá)、生理功能學(xué)等各方面指標(biāo)的影響，從客觀療效方面系統(tǒng)探討祛瘀與“新生血、脈、物”的深層次概念及關(guān)系。

消腫止痛合劑為甘肅省中醫(yī)院院內(nèi)制劑。由川芎、桃仁、紅花、赤芍、生地、當(dāng)歸、三七、木香、青皮、澤蘭等組成。具有活血化瘀、消腫止痛之功。大量的臨床應(yīng)用研究認(rèn)為，消腫止痛合劑可明顯促進(jìn)創(chuàng)傷后肢體腫脹消退，減輕疼痛、改善靜脈瘀血，減輕炎癥反應(yīng)［19-21］。有研究報(bào)道，在灌服大鼠鼠尾再植模型中發(fā)現(xiàn)，消腫止痛合劑能夠使大鼠血清中VEGF含量升高，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，利于離斷血管的修復(fù)［21］。但這些研究?jī)H僅涉及促血管生成的物質(zhì)，而并未客觀觀察到血管再生的情況以及基于何種原理來(lái)促進(jìn)血管修復(fù)，這仍是今后研究的目標(biāo)。

因此，能否通過(guò)介導(dǎo)Dll4-Notch信號(hào)通路促進(jìn)血管生成，這將是中醫(yī)藥在創(chuàng)傷、顯微外科組織修復(fù)方面新的研究方向［22-23］，能夠進(jìn)一步豐富中醫(yī)藥理論。