昆蟲抗菌肽在抗腫瘤方面的研究與應(yīng)用*

王瑜瓊 李沛哲 王 琪 郭 姍 趙瑞君** 程璟俠

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001； 2.山西省疾病預(yù)防控制中心病媒生物防控科，山西太原 03000l)

惡性腫瘤是導(dǎo)致數(shù)以百萬計(jì)人死亡的重要原因之一。對腫瘤患者的放、化療可對正常的組織及細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用(Cassidyetal.,2002)。瑞典科學(xué)家Boman等分離得到天蠶素(Cecropin)抗菌肽A和B后,人們開始對抗菌肽有新的認(rèn)識(Houetal., 2017)。昆蟲抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一種從昆蟲血淋巴中提取出來的天然多肽，分子量小，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不易被消化酶水解，不易產(chǎn)生耐藥性，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分(Mulderetal.,2013)。對昆蟲抗菌肽的研究發(fā)現(xiàn)它有一系列常用腫瘤療法所沒有的優(yōu)點(diǎn)對昆蟲抗菌肽的研究發(fā)現(xiàn)它有一系列常規(guī)腫瘤療法所沒有的優(yōu)點(diǎn)，專家們紛紛將目光轉(zhuǎn)向抗菌肽，這種獨(dú)特的昆蟲抗菌肽資源受到廣泛重視，研究內(nèi)容集中在昆蟲抗菌肽的分類方法、結(jié)構(gòu)特征、生物學(xué)活性檢驗(yàn)、抗腫瘤機(jī)制、前景展望等方面。

1 昆蟲抗菌肽的分類及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

昆蟲在受到免疫刺激后，血淋巴可以產(chǎn)生具有抗菌、抗腫瘤活性的多肽類物質(zhì)——抗菌肽。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在鱗翅目、膜翅目、等翅目等昆蟲中均有抗菌肽的存在。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同,可分為4大類:天蠶素類抗菌肽、昆蟲防御素類抗菌肽、富含脯氨酸的抗菌肽、富含甘氨酸的抗菌肽。天蠶素類抗菌肽,分子內(nèi)含有2個兩性α螺旋結(jié)構(gòu),不含半胱氨酸,分子量在4 kDa左右,可作用于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌(Lauthetal.,1998)。防御素類抗菌肽,具有α螺旋結(jié)構(gòu)和β折疊結(jié)構(gòu),分子量為4 kDa,對革蘭氏陽性菌具有抗菌活性(Bonmatinetal.,1992)。富含脯氨酸的抗菌肽類,可分成2個家族，即短鏈(小于20個氨基酸)和長鏈(大于20個氨基酸)，由15～34個氨基酸組成, 分子量為2～4 kDa,只作用于革蘭氏陰性菌(Buletetal., 2005)。目前，鱗翅目、雙翅目、半翅目、膜翅目中均已提取出富含脯氨酸的抗菌肽。富含甘氨酸的抗菌肽類一級結(jié)構(gòu)中都富含甘氨酸,分子量為10～30 kDa,可對革蘭氏陰性菌產(chǎn)生抗菌作用(Breyetal.,1998)。

2 昆蟲抗菌肽的抗腫瘤生物學(xué)活性檢驗(yàn)

昆蟲抗菌肽可以非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常體細(xì)胞無毒性影響，這預(yù)示著抗菌肽作為一種新型抗腫瘤藥物在臨床應(yīng)用中具有光明的前景。王文健等(2015)用家蠅Muscadomestica幼蟲抗菌肽對腫瘤細(xì)胞sup-b15急淋白血病小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該抗菌肽具有增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用。包永芬等(2010)將草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda卵細(xì)胞系SF-9產(chǎn)生的抗菌肽作用于荷人宮頸癌細(xì)胞 SiHa 裸鼠模型，發(fā)現(xiàn)隨著作用時間的延長, 腫瘤細(xì)胞增殖速度逐漸減慢,呈劑量—效應(yīng)關(guān)系和時間—效應(yīng)關(guān)系。趙瑞君等(2007)提取家蠅成蟲體內(nèi)的抗菌肽并作用于腫瘤細(xì)胞K562(人髓樣白血病細(xì)胞株)、Daudi(人淋巴瘤細(xì)胞株)、109(人食管癌細(xì)胞株)及T24(人膀胱癌細(xì)胞株),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌肽對癌細(xì)胞109和癌細(xì)胞Daudi的殺傷率比對照組高40%～60%,對癌細(xì)胞K562和癌細(xì)胞T24的殺傷率可達(dá)到10%～20%。為研究小菜蛾抗菌肽對人肝癌細(xì)胞株HepG2的作用，肖云芝等(2015)通過MTT比色法觀察小菜蛾P(guān)lutellaxylostella抗菌肽溶液對HepG2肝癌細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)其可對肝癌細(xì)胞株HepG2增殖的產(chǎn)生抑制作用。焦莉萍等(2012)用MTT法檢測不同濃度家蠅抗菌肽防御素對SW480、SIHA、HepG2三種腫瘤細(xì)胞及正常人心肌細(xì)胞HCM的作用效果，發(fā)現(xiàn)在不同濃度抗菌肽MD的作用下，腫瘤細(xì)胞的生長均受到抑制，正常人心肌細(xì)胞HCM無抑制現(xiàn)象。杜斌等(2015)用家蠅幼蟲抗菌肽粗提取物作用于原代FBL-3細(xì)胞，顯微鏡下觀察到原代FBL-3細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞。其細(xì)胞周期表現(xiàn)為G0/G1期的細(xì)胞比例增加，S期的細(xì)胞比例下降。

3 昆蟲抗菌肽的作用機(jī)制

從瑞典科學(xué)家初次發(fā)現(xiàn)抗菌肽以來，它的抗腫瘤作用機(jī)制逐漸清晰，傾向于聯(lián)合多種理論來解釋。

3.1 對細(xì)胞膜的作用

目前，抗菌肽的膜損傷作用是眾多研究者普遍認(rèn)為的主要作用機(jī)制，學(xué)術(shù)界較為認(rèn)同的主要有“氈毯”模型、“通道”模型和“桶板”模型(尹昆侖等，2015)。(1)腫瘤細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸帶有負(fù)電荷(Leuschneretal., 2004)?？咕姆肿泳哂袔д姾傻膬捎Hα雙螺旋結(jié)構(gòu)，腫瘤與抗菌肽相互吸引并結(jié)合，整個腫瘤細(xì)胞膜被昆蟲抗菌肽充分包裹，形成“氈毯”樣結(jié)構(gòu)。“氈毯”形成膠束狀物質(zhì)，降低腫瘤細(xì)胞膜表面張力，從而使得其細(xì)胞膜遭到破壞。(2)抗菌肽分子的羧基和氨基端兩親α螺旋插入到腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)，形成超分子復(fù)合物，這就是所謂的“通道”模型(Matsuzaki, 1998)。(3)在“通道”模型的基礎(chǔ)上，多個抗菌肽分子彼此聚合作用形成圓桶狀聚合體，腫瘤細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)被擾亂。此時即形成電勢依賴性離子孔道，細(xì)胞內(nèi)容物大量外流，細(xì)胞滲透壓難以維持，細(xì)胞崩解死亡。這就是所謂的“桶板”模型(Ehrensteinetal.,1977)。

3.2 對染色體DNA的作用

抗菌肽可以有效抑制腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制。王芳等(1998)證實(shí)了腫瘤細(xì)胞K562的DNA序列可被抗菌肽CM4分離，而正常細(xì)胞卻不受其影響，充分說明了抗菌肽可特異性抑殺腫瘤細(xì)胞。劉忠淵等(2008)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新疆家蠶Bombyxmori抗菌肽可以與DNA雙螺旋的凹槽結(jié)合，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，堿基對的排列順序紊亂。

3.3 對細(xì)胞骨架的作用

Chen等(2003)研究發(fā)現(xiàn)天蠶素抗菌肽B3可使腫瘤細(xì)胞微管破裂，也就是說抗菌肽可通過對細(xì)胞骨架的破壞作用來抑制腫瘤細(xì)胞?？咕牡膿p傷作用對腫瘤細(xì)胞和人體正常細(xì)胞的細(xì)胞骨架均會產(chǎn)生，由于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架不能及時進(jìn)行自我修復(fù)，而人體正常細(xì)胞的細(xì)胞骨架系統(tǒng)完整發(fā)達(dá)，故不會造成嚴(yán)重的損傷。

3.4 對線粒體的作用

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場所，抗菌肽可以破壞腫瘤細(xì)胞的線粒體。線粒體膜結(jié)構(gòu)中的磷脂酸、磷脂酰乙醇胺等成分屬于負(fù)電荷磷脂的范疇(Van Meeretal., 2008)，而前已述腫瘤細(xì)胞膜磷脂分子帶負(fù)電荷，正負(fù)電荷的靜電吸引作用導(dǎo)致線粒體膜發(fā)生破壞。由于膜電位的降低，能量代謝功能發(fā)生障礙，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。Huang等(2011)發(fā)現(xiàn)豹毒素作用于線粒體膜產(chǎn)生孔道，導(dǎo)致線粒體膜電勢降低，細(xì)胞色素C的大量釋放，活性氧大量釋出，HT-1080的凋亡激活，抗腫瘤作用產(chǎn)生。

3.5 提高抗體免疫效應(yīng)

抗菌肽在抑腫瘤過程中還發(fā)揮著促進(jìn)機(jī)體固有免疫和獲得性免疫的作用(Alvarezcalderonetal., 2013)?？咕目梢栽鰪?qiáng)提呈細(xì)胞的提呈和攝取能力，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性；增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性，消除機(jī)體對腫瘤抗原的免疫耐受性，最終加強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的抑殺效果；作為抗腫瘤細(xì)胞的免疫佐劑。

4 基因工程抗菌肽的設(shè)計(jì)與發(fā)展

鑒于抗菌肽在昆蟲體內(nèi)含量極微，提取工藝復(fù)雜，成本較高，耗時較長，不方便大規(guī)模生產(chǎn)的困難，利用基因工程技術(shù)制備抗菌肽是可能的途徑之一。其中，高效的表達(dá)系統(tǒng)是制約抗菌肽基因工程生產(chǎn)的重要因素。(1)原核表達(dá)。由于大腸桿菌具有遺傳背景清晰、可以快速高密度培養(yǎng)、外源性基因易于表達(dá)、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，因此，常用于抗菌肽基因的表達(dá)。目前多采用融合表達(dá)技術(shù)來生產(chǎn)抗菌肽(Choetal., 2014)。(2)真核表達(dá)。酵母表達(dá)系統(tǒng)是常見的真核表達(dá)系統(tǒng)。但是酵母的高密度培養(yǎng)很難實(shí)現(xiàn)，且抗菌肽在酵母中表達(dá)會發(fā)生酰胺化不完全的現(xiàn)象(Elisaetal., 2014)。CHO細(xì)胞是目前公認(rèn)的較理想的真核表達(dá)系統(tǒng), 表達(dá)的生物蛋白與天然蛋白分子相比，在分子結(jié)構(gòu)、抗腫瘤生物活性等方面比較相似，可以準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)錄和修飾目的蛋白。

5 展望

昆蟲繁殖力強(qiáng)容易飼養(yǎng)，是提取制備抗菌肽的適宜來源。家蠅抗菌肽具有相對穩(wěn)定的理化性質(zhì),受溫度影響小,耐高濃度鹽液和較極端的pH溶液，不易被消化酶水解，這些特點(diǎn)為人類的儲存、運(yùn)輸抗菌肽提供了便利的條件(Chuetal., 2004)。令人欣慰的是針對抗菌肽的研究和開發(fā)已經(jīng)取得了令人矚目的成就。Pexiganan是一種爪蛙素衍生物，在治療糖尿病足部潰瘍時的療效可以與抗生素氧氟沙星媲美(Wenetal., 2016), 如馬蓋寧公司研發(fā)的對糖尿病性足潰瘍有效的抗菌肽Pexiganan已完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，Xoma公司的對細(xì)菌性腦膜炎有效的抗菌肽rBPI21及Migenix公司的對導(dǎo)管插入感染有效的抗菌肽Omiganan也都完成了Ⅲ期臨床試驗(yàn)。

昆蟲抗菌肽應(yīng)用于臨床腫瘤治療的過程中還存在著許多問題：(1)昆蟲抗菌肽在體內(nèi)的活性和抗腫瘤效能是否與體外試驗(yàn)一致，是需要進(jìn)一步探討的內(nèi)容。(2)從昆蟲中提取昆蟲抗菌肽成本較高，尚需尋找一種經(jīng)濟(jì)、高效的替代制備方法。(3)昆蟲抗菌肽在臨床應(yīng)用前還需進(jìn)行相關(guān)的藥理、毒理實(shí)驗(yàn)。昆蟲抗菌可能會成為抗腫瘤治療過程中一個重要選項(xiàng)。